去乙酰化酶抑制剂对缺血神经元保护作用的分子机制研究

Recent studies revealed the disruption of dynamic balance of acetylation modification during stoke, and histone deacetylase inhibitors (HDACis) could attenuate the extent of injury and promote the recovery of ischemic neurons, which brings new hope for the treatment of stoke, however, the underlying mechanism of the neuroprotective effects of HDACis is uncertain. In the past five years, acetylation has been proved to be a regulatory modification to rival phosphorylation. Acetylation not only influences the gene expression by modifying the histone tail, bu also changes the non-histone protein structure and function. In the present study, an in vitro ischemic neuron model is establish by using primary cultured rat cortical neurons. High-throughput comparative proteomic analyses based on isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) combined with antibody enrichment of acetylation peptides and online two-dimensional nanoscale liquid chromatography and tandem mass spectrometry are performed to analyze the effects of ischemia on the proteome and acetylome of neuron and the effects of HDACi SAHA on proteome and acetylome of ischemic neuron. By further bioinformatics analyses, and biological expression and functional validation, we hope to reveal the underlying molecular mechanism of the neuroprotective effects of HDACi on ischemic neuron, from two aspects: protein expression and protein acetylation, and to deepen our understanding of Acetylation Biology, as well as promote the application of HDACi in clinical treatment of stoke and the development of more effective HDACis.

近年研究发现，卒中伴随着蛋白乙酰化动态平衡的丢失,而去乙酰化酶抑制剂(HDACis)可降低神经元的缺血损伤程度并促进其功能恢复，这给卒中的治疗带来了新的希望，但目前对其确切的作用机制还不了解。最近，可逆的蛋白乙酰化修饰已被证明是一种广泛存在的、保守的蛋白质翻译后修饰方式，不但可通过组蛋白的修饰影响基因的表达，还可直接影响非组蛋白的结构和功能。本研究拟建立大鼠皮层神经元的缺血模型，采用抗体亲和富集乙酰化肽段,iTRAQ稳定同位素标记和2D nano LC/MS/MS的定量蛋白质组学方法，分别检测去乙酰化酶抑制剂SAHA对缺血神经元的全蛋白表达谱和乙酰化蛋白表达谱的影响，并通过进一步的生物信息学分析和功能验证，从蛋白表达和蛋白乙酰化修饰两个方面探讨SAHA对缺血神经元保护作用的分子机制，为推动HDACis在卒中临床治疗中的应用和开发更有效的HDACis提供实验基础和进一步研究的方向。

建立SH-SY5Y细胞的OGD损伤模型，观察到OGD损伤后SH-SY5Y细胞活性较对照组显著降低，MMP较对照组显著降低，而ROS含量较对照组显著升高，Hoechst 和PI双染显示随着OGD时间的延长，凋亡及坏死细胞数增多。OGD损伤后SH-SY5Y细胞乙酰化水平显著下降。SAHA预处理2h，显著提高缺血缺氧损伤导致的SH-SY5Y细胞活性下降。0.5μmol·L-1 SAHA预处理2h，可显著减少OGD引起的细胞凋亡及坏死，减少细胞LDH释放，降低胞内的ROS，提高MMP和细胞乙酰化表达水平。SAHA对OGD诱导SH-SY5Y细胞缺氧/缺糖损伤具有明显的保护作用，其保护机制可能与SAHA上调蛋白乙酰化水平，从而降低细胞内氧化应激水平及维持MMP有关。.线栓法建立小鼠局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型（MCAO）；采用iTRAQ 稳定同位素标记和2D nanoLC/MS/MS 的定量蛋白质组学方法，检测缺血和SAHA 对缺血脑蛋白表达的影响。Gene ontology (GO) 分析差异表达蛋白的生物学功能，并通过Western blot 验证蛋白质组学的检测结果。结果显示小鼠缺血再灌注损伤引起较大面积的脑梗死灶，并出现明显的神经功能缺失。SAHA的处理能显著降低脑梗死面积并改善缺血再灌注损伤后的神经功能学评分。Western blot检测结果显示缺血引起大脑蛋白质乙酰化修饰水平的下降，而SAHA 可抑制缺血引起的蛋白质乙酰化修饰水平的下降。所测样本中共鉴定到1577种蛋白质。I/R组与Sham组比，68种蛋白的表达发生显著变化，其中上调蛋白33种，下调35种。上调的主要为血液蛋白成分、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异表达的蛋白,下调蛋白包括细胞骨架成分、参与蛋白合成和修饰的蛋白，转运相关蛋白。与I/R组比，SAHA处理改变了部分差异蛋白的变化趋势，缺血后增加的33种蛋白中有14种被下调，而34种下降的蛋白中则有19种被上调。本研究首次从蛋白质组的层面展现了HDACi对脑缺血再灌注损伤所具有的多重保护作用：保护血脑屏障、降低胶质细胞活化、稳定细胞和组织结构、改善能量代谢。这不仅证实了已有的研究结果，更重要的是发现SAHA处理可改变缺血对脑蛋白表达影响的趋势，这有可能是SAHA对脑缺血损伤多重保护作用的重要原因。此外，星形胶质细胞也被发现参与了SAHA对脑缺血的保护作用。