登革病毒RNA结合宿主RBP的新发现及其在病毒基因组复制中的分子机制

Dengue virus (DENV) is belongs to one of most harmful arbovirus in tropical and subtropical region.To date there are no effective vaccines and drugs. The DENV genome is positive strand RNA, the unlcear replication mechanism is the bottleneck of antiviral drug development. A substantial body of literature and our research shows that host RNA binding protein (RBP) plays an important regulatory role in DENV RNA replication. Howerer, their kind and function of host RBP binding DENV RNA is not entirely clear. We have recently established the method for isolation of RBP based on the in vitro assembled RNP complex, and got several RBPs. The role of a few of RBP in DENV RNA replication was preliminary studied. In this project, DENV replicon and RNA afinity tag and cell fraction extraction was intergated to develop novel strategy for isolating RNP complex assembled in cellular context. It can screen the RBP binding DENV RNA during virus replication. Furthermore the functional RBP in the DENV replication was chosen depending on its effect on virus replication.In the end, the precise molecular regulatory mechnism of RBP on DENV RNA replication is elucidated. The results of this project will help to understand the molecular mechanism of DENV replication, and may find the novel drug target for developing antiviral treatment.

登革病毒（DENV）是热带与亚热带发病最多、危害最大的虫媒病毒，迄今尚无有效的疫苗和药物。DENV为单股正链RNA，其复制机理不清楚是抗病毒药物开发的瓶颈。大量文献和我们的研究表明，宿主RNA结合蛋白（RBP）在DENV RNA复制中起着重要调控作用，但是其种类和功能尚不完全清楚。我们最近建立了从体外合成RNA组装核糖核蛋白（RNP）复合物中分离RBP的方法，获得了数个RBP并对个别分子在DENV RNA复制中的作用做了初步探讨。本课题拟在此基础上，整合DENV 复制子、RNA亲和标签技术和细胞组分提取技术建立一种RNA亲和分离细胞内组装RNP复合物的新策略，系统筛选复制状态下与病毒RNA 结合的蛋白质；进一步鉴定在DENV复制中起作用的RBP；阐明新的候选RBP在DENV RNA复制中的具体分子机制。本研究的完成将有助于深入理解DENV RNA 复制机理，并可能获得潜在的抗病毒药物靶点。

登革病毒（DENV）感染已成为全球重要的社会公共问题之一，尤其是在热带和亚热带国家，它威胁着全世界大约40%人口的健康。迄今，尚缺乏特异性抗病毒治疗措施。DENV为单股正链RNA，其复制机理不清楚是抗病毒药物开发的瓶颈。最近多项研究显示，除了病毒蛋白外，宿主蛋白在病毒翻译和复制调控中起着重要作用。迄今为止，仅有少数参与DENV复制周期的宿主蛋白被鉴定出来。DENV基因组非编码区5'UTR和3'UTR是宿主RBPs的主要结合区域，在病毒的复制和翻译中起着重要调控作用。本研究主要通过RNA亲和捕捉实验分别分离了细胞外和细胞内组装的DENV RNA 5'-3'UTR-RBP复合物，并采用质谱技术对洗脱样品中的蛋白质种类进行了分析鉴定；共筛选到101个宿主蛋白可能与DENV-2 5'-3'UTR结合。其中，采用体外转录RNA与细胞裂解物结合的方法，筛选出78个蛋白可能与DENV-2 5'-3'UTR结合的宿主蛋白；采用细胞内转录RNA的方法，筛选与宿主蛋白自然组装成RNA-蛋白复合物，获得32个可能与DENV-2 5'-3'UTR结合的宿主蛋白。这些蛋白包括20个DExD/H蛋白家族成员、10个hnRNP蛋白、6个EIF蛋白、与PBs、IGF2BP等mRNA小体相关的蛋白有25个。DDX1、DDX6、HNRNPD、PABP、hnRNPC、PTB和PCBP等十多个蛋白已有报道与病毒RNA结合，参与黄病毒科病毒在细胞内的复制过程。我们进一步研究发现，在DENV-2感染的细胞中LSm1、PatL1、RPS8和DDX1、DDX3、DDX6、DDX56等蛋白可促进病毒复制。LSm1是通过3'UTR与DENV RNA结合；RPS8蛋白与DENV RNA 5'UTR和3'UTR 均有相互作用，可能参与DENV RNA的环化或者直接与环化结构结合。在DENV-2感染的细胞中，DDX21从细胞核募集到细胞质中，通过3'UTR与DENV-2 RNA结合，可诱导IFN-β产生并抑制DENV的复制，而 NS2b/3蛋白降解募集到细胞质中的DDX21，进而有利于DENV-2在细胞内的复制。DDX50可以诱导IFN-β的表达抑制DENV-2的复制，并与RIG-I或者MDA5具有协同效应。本研究建立了一步法分离细胞内组装的RNA-RBP复合物的新方法；拓展了参与DENV复制相关RBP候选分子的范围。