新发现的登革病毒亚基因组非编码RNA的生物学功能研究

登革病毒感染导致的登革热和登革出血热在我国时有流行，对公共卫生构成重要威胁。登革病毒为单股正链RNA病毒，基因组两端为非编码区（NCR），在病毒的复制翻译过程中具有重要作用。最近，我们在登革病毒的感染的细胞中，发现了一种来自病毒基因组3'-NCR的亚基因组非编码RNA（sgRNA），但其结构与功能尚不明确。本研究以此为切入点，通过Northern Blot、FISH、实时RT-PCR等方法，对新发现的登革病毒sgRNA的生化学特征进行全面鉴定；结合EMSA、AFM、RNAi、VIRG和复制子技术，鉴定与sgRNA相互作用的病毒和宿主因子，阐明sgRNA对病毒复制翻译的调控机制；并利用反向遗传学技术构建一系列sgRNA突变型病毒，进一步明确其对病毒感染力和致病性的影响，为登革病毒致病机理的阐明和减毒活疫苗的研制奠定基础。

登革病毒感染导致的登革热和登革出血热在我国时有流行，对公共卫生安全构成重要威胁。登革病毒为单股正链 RNA 病毒，基因组两端为非编码区(UTR)，在病毒的复制翻译过程中具有重要作用。最近，我们在登革病毒的感染的细胞中，发现了一种来自病毒基因组3'-NCR的亚基因组非编码 RNA (sgRNA),但其结构与功能尚不明确。. 在本研究中，我们首先通过Northern杂交、实时RT-PCR等方法明确了登革病毒sgRNA在不同来源的细胞系（蚊、鼠、猴、人）中的表达特征，发现sgRNA的产量及其与基因组RNA的比例存在一定宿主依赖性；进一步通过5’RACE法测序获得了登革1-4型病毒sgRNA的核苷酸序列，与病毒基因组序列进行比较，确认了相应sgRNA的5’-端起始位点和准确分子量大小，与Northern杂交实验结果完全吻合；进而使用RNAfold软件对sgRNA的二级结构进行预测发现，sgRNA起始位点后存在结构相对保守的茎环（SL）结构，利用复制子系统通过突变分析证实了登革病毒sgRNA的产生与3’SL元件密切相关。. 在此基础上，通过体外sgRNA过表达的方式对登革病毒sgRNA的生物学功能进行了分析，结果发现，过量sgRNA对病毒基因组负链RNA没有显著影响，但可以显著提高病毒基因组正链RNA的拷贝数，说明sgRNA对病毒基因组复制具有上调作用。同时，利用VIRG报告系统对sgRNA的生物学功能进行分析发现，登革病毒sgRNA对病毒基因翻译的抑制主要发生在起始过程。进一步通过突变分析发现，环化序列（CS）突变可破坏sgRNA与病毒基因组5’-端互补序列的结合，进而，CS突变不仅消弱了sgRNA的复制增强作用，而且干扰了sgRNA对病毒翻译的抑制作用。因此，登革病毒sgRNA可以认为是一种反式调节性 RNA元件，需要借助于环化序列与病毒基因组 5’-端结合而发挥调节作用。基于上述发现，我们提出登革病毒sgRNA参与调控病毒基因组的分子模型，为现有登革病毒环化复制模型提供了有力补充。登革病毒sgRNA分子的发现及其生物学功能的阐明，深刻揭示揭示了源自病毒基因组3’-UTR的非编码RNA小分子的反式调节功能。. 在本项目的支持下，先后发表SCI论文5篇，中文综述2篇，会议论文1篇；培养博士研究生2名，硕士研究生1名。