肝癌中PEG10基因印记状态改变的表观遗传学机制研究

近年发现大多数肿瘤组织中存在印记基因的印记缺失所致的双等位基因高表达现象。差异性甲基化区域（DMR）被认为在印记调节中起重要作用。遗传印记基因PEG10在原发性肝癌组织中有高表达，推测PEG10的印记缺失可作为肝癌发生危险性的分子标记。本课题将在临床切除的肝癌标本中利用RT-PCR-RFLP结合银染技术分析PEG10基因的印记状态，揭示PEG10的印记缺失与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系；研究PEG1O基因内部DMR的甲基化情况，明确PEG10基因印记缺失和PEG10DMR甲基化状态改变的相关性；在肝癌细胞株上证实去甲基化药物是否能重新诱导PEG10被印记并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征，探索去甲基化药物对肝癌的治疗价值。该研究对进一步揭示肝癌发病的表观遗传学机制、设计合理的治疗药物及判断预后，提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。

本课题组首先采用免疫组织化学法检测50例临床切除原发性肝细胞癌（HCC）和相应癌旁组织中PEG10蛋白的表达。发现PEG10在HCC组织中的阳性表达率高于相应癌旁组织中的表达率，且PEG10的表达与肝癌患者TNM分期具有相关性，与患者的性别、血清HBsAg水平、年龄、血清AFP水平、肿瘤大小、是否伴随肝硬化不存在相关性。.为了进一步从表观遗传学角度分析PEG10甲基化水平，课题组分析了PEG10基因的印记状态和PEG10基因内部DMR的甲基化情况。发现50例临床手术切除的人肝癌标本及癌周肝组织中分别筛选到14和16例PEG10基因的杂合子信息个体，杂合率差异无统计学意义。在上述14例肝癌组织中筛选到5例PEG10基因发生印记缺失；在上述16例肝癌旁组织中筛选到4例PEG10基因发生印记缺失。测序结果发现：在5例PEG10基因印记缺失的肝癌组织中，有4例组织的PEG10基因DMR区域出现了甲基化程度的增加。在4例PEG10基因印记缺失的肝癌旁组织中，有1例PEG10基因DMR区域出现了甲基化程度的增加肝癌组织PEG10-DMR 发生甲基化的CpG位点数显著高于癌旁肝组织。.最后课题组用去甲基化药物5–氮杂–2ˊ–脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理肝癌细胞株HepG2，检测细胞增殖、细胞周期和凋亡以及侵袭能力的变化，并检测PEG10 mRNA和蛋白表达水平的变化。发现5-Aza-CdR处理HepG2细胞后，细胞的增殖均有显著的抑制作用，呈明显的浓度效应和时间效应。5-Aza-CdR处理后的HepG2细胞S期细胞所占比例较阴性对照组明显增多，G1期细胞所占比例较阴性对照组明显减少。处理后HepG2细胞早期凋亡率和晚期凋亡率高于阴性对照组早期凋亡率和晚期凋亡率。且5-Aza-CdR 处理72h后，HepG2的体外侵袭能力明显下降，穿过基底膜的细胞数量明显减少。RT-PCR和western blot 证实处理组PEG10mRNA 和蛋白表达水平显著下降。课题组在体外水平证实了去甲基化药物能重新诱导PEG10被印记并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征。.上述研究结果对进一步揭示肝癌发病的表观遗传学机制、设计合理的治疗药物及判断预后，提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。