以斑马鱼为模式动物对缺氧诱导因子HIF-3α的功能研究

缺氧诱导因子HIF-α家族在胚胎发育以及多种疾病的发展中均发挥重要的作用，是诱导与缺氧反应有关基因表达最有效的转录因子。目前对于HIF-α的认识主要来自于HIF-1α和HIF-2α。近年来发现HIF-α家族的另一成员HIF-3α，但是对其功能知之甚少，认为其可能是作为转录抑制因子，对HIF-1α和HIF-2α所调节的基因表达起到抑制作用。本课题以斑马鱼为模式动物，利用斑马鱼胚胎透明、体外发育的特点，探讨在胚胎发育过程中HIF-3α的功能以及是否存在受其直接转录调控的靶基因，进一步分析环境胁迫对其调控作用；研究HIF-3α与HIF-1/2α间的功能关系及相互作用机制，重点研究其是否作为转录抑制因子来调节HIF-1/2α的功能。这一研究将发现HIF-α家族活性调控的新机制，为不同HIF-α 之间相互作用机制提供直接的生物学证据。

本课题利用模式生物斑马鱼和体外细胞培养，对克隆得到的对斑马鱼缺氧诱导因子HIF3进行了功能性的研究。项目基本按照原来的计划进行，目前已经完成了课题任务书的全部工作，发表SCI论文两篇。但是本课题有一个重要发现：HIF3是一个新的转录因子，而不是转录抑制因子。因此对其转录活性做了大量的研究工作。并且发现一个不受缺氧调控的hif3可变剪切体hif513. 目前课题还在其他项目经费的支持下进行。.斑马鱼中Hif-3a位于 15 号染色体，全长 2196 bp，ORF 为 l，881 bp。呈现全身性表达模式， 4 hpf 开始有明显表达，随后逐渐升高并维持在稳定水平；在成鱼肾脏和卵巢中 3a 表达最高。Hif-3a在转录水平和蛋白受氧气调控，0DD结构域中两个保守脯氨酸基序介导了 hif-3a 常氧条件下的降解。.亚细胞定位显示 Hif-3a 是核蛋白，说明 Hif-3a具有作为转录因子的特征。利用荧光素酶报告体系，发现斑马鱼 Hif-3a能显著促进报告基因的表达； 与dnhif-3a ( 3a)共转染，则抑制报告基因的表达。显微注射 Hif-3amRNA能显著上调报告基因，同时igfbp1b和 rtp801 的表达水平也明显上升； dnthif3a 能抑制缺氧对igfbp1b 和 rtpS01 的上调作用；这表明 Hif3a 能够作为转录因子调节内源基因的表达。Hif-3a 具有独立的转录活性，且不影响 Hif-1a 活性。.本研究还克隆得到斑马鱼 Hif-3a一个新的转录本 H3-513。它的 ORF 长 513bp，含 5 个外显子，编码 170 个氨基酸，包括 TAD 和 LZIP 两个结构域，在时空表达模式上与 Hif-3a 类似。H3-513的 mRNA 和蛋白部不受氧气调控。H3-513 定位在细胞核中。体外转染细胞H3-513 能促进报告基因表达；胚胎注射 H3-513mRNA 显著增强内源基因 igfbp--la 的表达，说明 H3-513 具有转录活性；通过删除突变证实，TAD 结构域中保守的脯氨酸残基(Pr037)决定着 H3-513 的活性。过量表达 H3-513 导致胚胎出现一系列畸形，这说明它在体内具有重要作用。这些结果为深入研究Hif-3a的功能奠定基础，对全面认识和理解 HIF- a 家族具有重要价值。