以斑马鱼为模型研究牙齿再生的细胞和分子调控机制

Identification and characterization of tooth stem/progenitor cells are of great scientific and clinical interest. By establishing zebrafish tooth regeneration model, this project is aiming to identify the progenitors pivotal for tooth regeneration and study their cellular and molecular mechanisms. This project is divided into six parts: 1) Establishment of tooth injury and regeneration model in zebrafish. 2) Priliminary identification of tooth progenitor cells using our zebrafish tooth regeneration model. 3) Characterization of molecular markers of tooth progenitor cells. 4) Cell behaviors of tooth progenitors during the tooth injury and regeneration processes. 5) ENU forward genetic screen for the tooth regeneration mutants. 6) Roles and molecular mechanisms of mutated genes or other potentially important genes in tooth regeneration.

牙齿再生的细胞来源和分子机制研究具有重要的基础研究和临床意义。本项目拟以斑马鱼为模式动物，通过建立斑马鱼牙齿的损伤再生模型，致力于鉴定在牙齿再生过程中发挥关键作用的牙齿前体细胞，并揭示这些牙齿前体细胞发挥损伤后修复功能的细胞和分子机制。本项目有以下六项研究内容：1）斑马鱼牙齿损伤再生模型的建立；2）斑马鱼牙齿再生来源细胞/牙齿前体细胞的初步定位；3）斑马鱼牙齿前体细胞特异性分子标记的的建立；4）斑马鱼牙齿前体细胞的确证及在牙齿损伤再生过程中的细胞行为研究；5）具有牙齿再生缺陷的ENU正向遗传诱变筛选及致变基因的定位克隆；6）突变体致变基因及其它重要候选基因在牙齿再生过程中的功能和作用机制研究。

牙齿在人类重要器官，参与食物的咀嚼、发音、面部发育及美观等重要功能。临床上常见因龋坏、牙周病、外伤、颌面部肿瘤等口腔疾病而导致牙列缺损、缺失，使得牙再生成为口腔医学研究的重点。.斑马鱼咽齿在发育阶段、组织结构、矿化方式等各方面也与人类牙齿具有极大的相似性，是研究牙齿发育与再生分子机制的理想模式动物。.本项目成功完成斑马鱼咽齿损伤再生模型的建立：构建了转基因鱼（Tg：dlx2b-dendra2-NTR），经三代筛选，转基因鱼荧光蛋白表达稳定。在3dpf时，可观察到绿色荧光在斑马鱼咽齿部分表达，周围鳃骨无表达，在6dpf后，荧光逐渐消失。利用MTZ/NTR损伤系统，在3dpf时，用MTZ溶液对转基因斑马鱼进行处理，48h后可观察到荧光基本消失，此时停止处理，恢复24小时后，可观察到荧光开始恢复。非特异性探针cx43整胚原位杂交及胚胎茜素红染色显示MTZ处理后牙胚消失，恢复24小时后，牙胚再生。项目还初步探究了视黄酸（RA）在斑马鱼咽齿发育过程中的作用。RA信号是斑马鱼生长发育过程及维持成年斑马鱼生态内环境稳态的重要信号通路，本研究中给予外源性RA后，可使斑马鱼barx1在咽弓神经嵴的表达信号增强，同时，dlx2a在咽弓神经嵴的表达较控制组提前，在前脑区的表达也明显增强，推测适宜浓度RA可促进斑马鱼颅神经嵴迁移至咽弓，分化为咽弓神经嵴和间充质干细胞，为进一步与牙源性上皮相互作用形成牙齿提供细胞来源。而在给予DEAB阻断斑马鱼体内RA合成后，barx1表达出现下调，dlx2a表达也限于前脑区域，揭示颅神经嵴后迁过程受到抑滞，未完成咽弓神经嵴的形成和间充质干细胞的分化。对osterix在斑马鱼早期颅颌面骨骼及牙齿发育过程中的表达进行了初步研究；本项目还建立了转基因鱼系Tg (Hsp-cyp26a1-GFP; cryaa-Venus)，热激后，cyp26a1体内表达增加，RA降解增加，此组标记物表达情况与DEAB组相似，该鱼系将持续进一步研究。同时，本项目还就牙齿发育再生相关的血管发育再生、骨间充质干细胞生物学功能、牙齿根管形态学等进行了系列相关研究。.项目实施过程中，发表论著15篇，其中SCI论文7篇、CSCD核心论文8篇，申请国家发明专利公示1项，培养硕士研究生毕业9人。