核糖体生物合成蛋白Esf1影响斑马鱼胚胎发育的机制研究

Nucleolar proteins which involved in ribosome RNA synthesis and assembly play very important role in ribosome biogenesis. Mutations in nucleolar proteins often cause tissue-specific disease. The mechanisms underlying the tissue proclivity in ribosomopathies are need to be defined. Recently our research showed that a novel zebrafish craniofacial mutant, esf1 mutants, generated via the CRISPR/ Cas9 system exhibited a phenotype because of cranial NCCs defects. The esf1 mutants show that they are lack of all virtually pharyngeal arch cartilages, defects in eye, brain, heart, and a significant increase in cell apoptosis. Inactivation of p53 could rescue the early defects observed in esf1 mutants, indicating that increased cell death and defects observed in esf1 mutants was mediated via up-regulated p53 signaling pathways. In this proposal, we use zebrafish, an excellent model system in development research because of transparent embryos and in vitro development, to explore the role of esf1. Combining gene overexpression, loss of function and gain of function, Cas9 gene editing with cell culture in vitro, we will investigate the function of esf1 in early development, and how it interact with p53 signaling pathways and affect ribosome biogenesis. This study will uncover the mechanism how p53 is regulated in vivo by esf1, and ultimately provide the data for the zebrafish as a model organism in investing the functions of nucleolar proteins.

核仁蛋白作为核糖体RNA合成以及核糖体组装的主要参与者，对核糖体生物合成过程的调节至关重要，核仁蛋白突变导致特定组织器官的异常和病变。研究不同核糖体生物合成相关蛋白独特功能，阐明其作用机制将为核糖体病变的组织特异性提供线索。我们前期研究利用CRISPR/Cas9技术，构建了模式动物斑马鱼核仁因子esf1基因突变体。发现esf1基因突变导致斑马鱼咽弓软骨严重缺失，细胞凋亡等表型，并且发育缺陷和p53信号通路密切相关。本项目拟在前期发现esf1在早期发育中的功能基础上，以斑马鱼为模式动物，利用斑马鱼体外受精、体外发育的优势，通过构建esf1、tp53双基因突变体、体内过表达等方法，结合体外实验，探讨esf1影响胚胎发育的机制，明确其是否参与调控p53的稳定性以及核糖体生物合成。研究结果将全面揭示esf1在动物早期胚胎发育中的地位作用，最终为斑马鱼作为研究核仁蛋白功能的模式生物提供依据。

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在模式生物斑马鱼中对esf1基因进行了敲除。通过一系列的突变体筛选流程、测序鉴定突变类型，获得了3种esf1基因有义突变类型。RT-PCR 分析显示，esf1为母源性基因，在胚胎各个时期均有表达。整胚原位杂交分析显示esf1主要在神经嵴以及咽弓软骨等神经嵴的衍生器官中表达。对esf1突变体的表型观察分析，发现esf1突变体胚胎早期隐性致死。通过阿尔新蓝染色发现esf1突变体咽弓软骨严重缺失。由于咽弓软骨是CNCC的衍生器官，推测是由神经嵴的发育异常所致。以多个神经嵴的标记基因对esf1突变体的神经嵴细胞进行原位杂交，发现esf1突变影响了神经嵴细胞的迁移以及咽弓软骨的形成。通过对esf1突变体的胚胎进行吖啶橙染色分析，发现神经嵴细胞严重凋亡。通过显微注射p53 MOs进行营救实验，发现神经嵴细胞的凋亡明显降低，证明了esf1的突变激活了p53信号通路诱导了细胞凋亡。结果表明， esf1的突变激活了p53信号通路，导致严重的细胞凋亡，引发神经嵴发育异常，从而造成下颌软骨严重缺失等表型，致使突变体胚胎在早期隐性致死。这一研究结果，首次发现了核仁基因esf1在生物体生长发育过程中的功能，拓宽了对神经嵴发育遗传机制研究的视野，并对脊椎动物的早期胚胎的神经嵴发育以及人类先天性疾病的研究提供了一定的理论依据。