茶儿茶素合成代谢中B环5'羟基化反应发生位点的研究

茶儿茶素为2-苯基苯并吡喃衍生物，属于类黄酮中的黄烷醇类化合物，是茶叶中主要的次生代谢产物之一。茶儿茶素有六种类型，其中B环3'4'5'-三羟基儿茶素EGC及其酯化产物EGCG约占儿茶素总量的70%。但至今茶儿茶素代谢中B环5'羟基化反应的发生位点仍不清楚。项目组前期研究表明，茶树体内难以检测到催化EGC合成的ANR酶活性，可能存在EC水平上的B环5'羟基化反应。为了验证体外酶学检测结果的可靠性，本项目拟在克隆茶树F3'5'H、ANR基因的基础上，利用异源体外表达和农杆菌介导的茶树细胞同源转化，开展茶树F3'5'H、ANR基因的体外功能分析和体内功能验证研究，从分子和酶学水平上揭示茶儿茶素合成代谢中B环5'羟基化反应的发生位点。本项目的开展将有助于探明儿茶素的生物合成的分子机制，为儿茶素生物合成的基因调控及代谢工程奠定理论基础。

儿茶素类(catechins) 为2-苯基苯并吡喃衍生化合物，属黄烷醇类化合物，主要类型包括儿茶素(catechin, C)、没食子儿茶素(gallocatechin, GC)、表儿茶素(epicatechin, EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC)以及表儿茶素类酯化产物(包括表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)。其中， C、EC和ECG为2-苯基苯并吡喃B环3’4’-二羟基的儿茶素，GC、EGC、EGCG为B环3’4’5’-三羟基的儿茶素。文献表明，后者中EGC及其酯化产物EGCG是茶树体内儿茶素的主要成分，约占儿茶素总量的70%。课题组多年儿茶素测定数据也有相似结论。本文在克隆茶树F3’5’H和ANR基因的基础上，利用原核表达、真核酵母表达以及烟草转基因技术，验证茶树F3’5’H基因体外功能，并利用荧光实时定量PCR技术研究了类黄酮代谢相关的表达差异。研究结果如下：.1、通过RACE技术克隆了预测的CsF3’5’H、ANR的全长序列。.2、构建了pET32a(+)-CsF3’5’H和ANR重组质粒，转入表达菌株rosetta(DE3)，进行原核表达。通过对诱导时间、诱导温度进行优化，确立以30℃为诱导温度，诱导5 h为最佳诱导条件。使用亲和树脂纯化了CsF3’5’H融合蛋白，纯度高达86.4%。.3、通过优化了HPLC条件，建立了茶树F3’5’H粗酶酶活的检测体系，证实茶树粗酶中确实存在F3’5’H酶的活性。.4、构建了茶树F3’5’H基因在酿酒酵母中的表达，并测定了部分酶对不同底物的活性，对柚皮素具有明显催化活性。.5、构建了pCB2004-CsF3’5’H重组质粒，导入农杆菌EHA105中，并成功的对烟草进行了侵染，获得了转基因烟草，验证了茶树F3’5’H基因功能。.6、通过实时荧光定量PCR研究了类黄酮B环羟基化相关基因在茶叶不同发育阶段的表达量。研究发现，F3’5’H在根中几乎检测不到表达量，说明其表达组织器官特异性。