LaeA调控黄曲霉毒素合成的蛋白组学研究

Aspergillus flavus, a common contaminant of agricultural commodities including peanuts, corn and wheat, can produce aflatoxins (AF) that are harmful to food safety and human health. LaeA, a global regulator in A. flavus, significantly regulated AF biosynthesis at transcription level. Due to the effect of post-transcriptional modifications, gene expression levels are not in accordance with protein abundance which is the direct evidence of gene expression. The current research of its regulatory mechanism involved in AF biosynthesis mainly focuses on transcription level and far less focuses on protein level; thus AF biosynthesis regulated by laeA on protein level remains unclear. In this study, proteomic profile of extracellular and intracellular proteins of A. flavus strains (wild type strain, produce AF; laeA gene deletion strain, not produce AF) were quantified by isobaric tagging for relative and absolute quantification (iTRAQ) technique. The proteins related to aflatoxin biosynthesis were identified by Gene Ontology (GO), Clusters of Orthologous Groups (COG) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis of the differential protein expression. To verify and explore the function and interrelated mechanism of associated proteins involved in AF biosynthesis, corresponding gene deletion and overexpression strains of A. flavus were constructed; characteristics of mycelium growth, gene transcription level of AF biosynthetic pathway and feedback of mycelium growth in response to environmental pressure were studied. The data uncovered in this study will provide theoretical basis for targets identification of biocontrol of AF-producing A. flavus.

黄曲霉在花生、玉米、小麦等农产品中产生的黄曲霉毒素（AF）严重危害食品安全及人类健康。研究表明，全局调控因子laeA在基因转录水平上对AF的合成具有显著调控作用，但基因转录水平并不能完全代表蛋白质的丰度，因而从蛋白质水平开展分析更能直接体现基因表达的真实概貌。目前，laeA在蛋白水平的调控研究则少有涉及，对其调控AF生物合成的分子机理尚不清楚。本研究拟采用新型iTRAQ蛋白组学技术系统分析黄曲霉产毒株（野生株）与无毒株（laeA缺失株）胞内外蛋白组学图谱，通过对差异表达蛋白进行功能聚类及代谢途径分析，分别确定胞内及胞外与AF合成关联的目标蛋白；通过研究目标蛋白对应基因缺失及过量表达对菌丝体生长特性、外界压力的反馈以及AF合成途径基因转录的影响，验证关联蛋白的功能，探讨其在AF生物合成过程中的分子调控机理。本研究对黄曲霉产毒菌株生物防治靶点确立提供理论基础。

由黄曲霉产生的黄曲霉毒素（AF）严重危害食品安全及人类健康。前期研究表明，全局调控因子laeA在基因转录水平对AF的合成具有显著调控作用。本研究以黄曲霉野生型菌株（产AF）及全局调控因子laeA缺失突变株（不产AF）为研究对象，研究了黄曲霉产毒和无毒菌株在小麦、玉米固体培养基及YES液体培养基中产毒规律及胞内外蛋白的差异，选取并构建差异蛋白对应基因突变株，考察其对菌体生长及黄曲霉毒素合成的影响，在蛋白水平初步阐述了laeA对黄曲霉毒素生物合成的调控作用。在此基础上，开展了黄曲霉翻译后修饰蛋白组学研究，为后续深入研究AF合成机理奠定基础。. 研究表明：（1）通过SDS-PAGE和质谱共鉴定到八种产毒株及无毒株胞外差异蛋白，分别为糖酵解途径的果糖二磷酸醛缩酶前体（fbaA）、磷酸丙糖异构酶前体（tpiA）；与菌丝营养摄入相关的木聚糖酶前体（xynF3）、糖化酶前体（glaA）、淀粉酶前体、碱性蛋白酶前体、和亮氨酸氨基肽酶前体；与菌体在生长过程中对抗外界氧化压力相关的过氧化氢酶B前体（catB）。（2）野生型和laeA缺陷菌株的蛋白组学研究确证了laeA对胞外水解酶类、分生孢子输水蛋白以及与氧化压力相关蛋白的调控作用。除此之外，研究结果表明laeA的缺失导致依赖于NAD+的组蛋白去乙酰化酶sirA的大幅度上调，该蛋白参与了染色体的重塑，促进了异染色体的形成，从而沉默了次级代谢基因簇的表达。除了黄曲霉毒素合成途径中的酶表达量下调之外，参与ustiloxin B合成途径中的酶也出现下调情况，表明该次级代谢产物可能也受到laeA的调控。（3）构建了差异蛋白对应基因catB敲除突变株，与野生型相比△catB突变株对外界氧化压力具有较强的耐受性，产毒能力有所增强。. 上述研究结果表明，laeA通过综合调控胞内外蛋白影响了包括黄曲霉在内的多种次级代谢产物的生物合成。胞外蛋白影响了黄曲霉生长及对宿主的侵染；胞内的去乙酰化酶上调促进了异染色体的形成，沉默了次级代谢基因簇的表达。本研究为进一步阐明laeA对黄曲霉毒素生物合成的调控作用提供了基础。