磷脂酰丝氨酸过量生物合成和代谢调控的研究

磷脂酰丝氨酸(PS)可提高脑细胞活力，对治疗老年痴呆症和儿童多动症疗效明显，对缓解抑郁、平衡情绪也有疗效，应用潜力巨大。目前PS生产方法效率极低，成为开发PS医药价值的瓶颈问题。本项目利用高效液相色谱技术建立细胞膜磷脂分析方法；根据代谢工程原理对大肠杆菌PS合成过程中关键酶进行调节，突变SerA以解除丝氨酸对其反馈抑制，提高serB、pss、pgps基因拷贝数，弱化PGS表达量，敲除psd基因以截断PS分解代谢，最终获得过量合成PS的工程菌株；同时利用代谢网络分析技术定量描述PS合成代谢中重要代谢物对PS合成的影响，以及不同发酵条件下碳源的流向和代谢流量分布，研究PS含量、胞膜中其它磷脂成分含量和菌体生长三者之间的关系，获得PS最优发酵工艺参数。解决细胞膜中PS难以富集的问题，探索出一条通过微生物直接过量合成重要功能因子磷脂类化合物的新思路，为进一步提高PS合成效率提供遗传修饰的理论基础。

磷脂酰丝氨酸（PS）可以提高脑细胞活力，对治疗老年痴呆症和儿童多动症疗效明显，应用潜力巨大。目前PS生产方法效率极低，成为开发PS药物的瓶颈问题。本项目用磷脂酰丝氨酸合成酶连接丝氨酸代谢途径和磷脂代谢途径，经微生物直接发酵来制备PS，达到过量积累PS的效果。本项目根据代谢工程原理研究大肠杆菌磷脂代谢途径，对PS合成过程中关键酶进行调节，突变SerA以解除丝氨酸对其反馈抑制，通过重叠PCR技术对serA基因的第344和346位密码子进行定点突变，突变后密码子均为gcc，编码丙氨酸。将突变后的serA基因插入到表达载体pET28a(+)，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。诱导表达酶活力为出发菌株的5倍，活力达到711 U/mL并且不受L-丝氨酸的反馈抑制。但是经检测，高表达突变基因对菌株的L-丝氨酸产量也没有显著影响。敲除L-丝氨酸脱氨酶表达基因sdaA、sdaB和tdcG，菌株的产L-丝氨酸能力提高到了0.13 mmol/L，较出发菌株有较大提升。为进一步积累PS奠定了基础。继而敲除编码磷脂酰甘油磷酸酯酶的pgpA、pgpB基因，并测定各个突变株PS的含量变化，K-12（∆sdaA∆sdaB∆tdcG）中为1%、K-12（∆pgpA∆pg pB∆sdaA∆sdaB）中为1.5%、K-12（∆pgpA∆pgpB∆sdaA∆tdcG）中为1.5%、K-12（∆pgpA∆ pgpB∆sdaB∆tdcG）中为1%，K-12（∆pgpA∆pgpB∆sdaA∆sdaB∆tdcG）中为2.5%。加入羟胺抑制磷脂酰丝氨酸的降解后，菌株K-12（∆pgpA∆pgpB∆sdaA∆sdaB∆tdcG）中磷脂酰丝氨酸的含量可进一步提高到12%左右。另外，随着磷脂酰丝氨酸的积累，菌体形态变长成丝状，而羟胺的加入则会使菌体的细胞璧内陷，菌体易裂解。.在菌株K-12（∆pgpA∆pgpB∆sdaA∆sdaB∆tdcG）的基础上，构建出重组表达质粒pSTV29-pssA-cdsA-serAdr，高效表达磷脂酰丝氨酸代谢途径中编码磷脂酰丝氨酸合成酶的pssA基因、CDP-二酰基甘油合成酶的cdsA基因、及定点突变后的3-磷酸甘油酸脱氢酶基因serAdr，再经羟胺处理，可获得磷脂酰丝氨酸进一步积累的工程菌株，最终可使磷脂酰丝氨酸的含量从0.5%提高到29%，开辟了微生物法直接合成PS的新途径。