JNK/MCP1与AIF/RIP3正反馈环路调控程序性坏死介导全脑缺血再灌注损伤的机制研究

Necroptosis is one of the important pathological mechanisms following cerebral ischemic injury. Our preliminary study confirmed that nuclear translocation of receptor-interacting protein 3 (RIP3) is involved in necroptosis after global cerebral ischemia/reperfusion (I/R) injury. The nuclear translocation and co-localization of RIP3 and apoptosis induced factor (AIF) indicates an interaction in which the AIF-RIP3 protein complex causes rat neuronal DNA fragmentation, a process which is associated with the JNK phosphorylation mediated inflammation pathway. Exploring the mechanism of AIF-RIP3 is the key to studying necroptosis. However, the effect of JNK and MCP1 on the regulation of AIF-RIP3 synthesis in global cerebral ischemic injury is not clear. This study is intended to demonstrate that the AIF/RIP3 pathway is a central mechanism of necroptosis and is mediated by a positive feedback loop involving activation of the JNK/MCP1 inflammatory pathway which promotes cerebral ischemic injury. We used both the rat global cerebral ischemia model and oxygen-glucose deprivation model on mixed cultures of neurons and glial cells to study this mechanism both in vitro and in vivo. And we utilized specific inhibitor, siRNA, recombinant adeno-associated virus, co-immunoprecipitation, immune-probe and laser confocal observation to explore whether the synthesis of the AIF-RIP3 protein complex and its nuclear translocation activates the JNK/MCP1 signal pathway to produce a positive feedback of inflammation after ischemic injury.

我们前期研究证实程序性坏死是全脑缺血再灌注损伤的重要机制之一。全脑缺血损伤后受体相互作用蛋白3（RIP3）作为程序性坏死的标志蛋白，以AIF-RIP3蛋白复合体形式向细胞核内位移诱导大鼠神经元DNA断裂，同时激活胶质细胞JNK介导的炎症通路，导致神经细胞死亡。如何调控AIF-RIP3成为探讨程序性坏死的关键。研究发现炎症因子与上游信号通路可能存在相互作用，但全脑缺血损伤后JNK及其炎症趋化因子MCP1是否对AIF-RIP3产生影响尚不明确。本项目拟建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型和体外细胞缺血模型，以特异性药物阻断剂、siRNA、重组腺相关病毒等作为干预手段，应用免疫荧光、共沉淀和激光共聚焦等方法，探索缺血损伤后AIF-RIP3合成及细胞核转移是否受到JNK/MCP1信号通路的调控，从而验证以RIP3为中心的程序性坏死与炎症通路的正反馈环路，可能是促进全脑缺血损伤的重要机制。

越来越多的证据表明，程序性坏死与炎症反应有关。受体相互作用蛋白3（RIP3）作为程序性坏死的关键蛋白，以AIF-RIP3蛋白复合体形式向细胞核内位移诱导大鼠神经元DNA断裂。本研究旨在探索大鼠脑缺血或者脑出血损伤后程序性坏死信号通路与炎症信号激活的相互关系。进一步揭示脑缺血损伤后JNK炎症信号通路对程序性坏死信号通路关联。.我们主要研究发现：大鼠在发生全脑缺血再灌注损伤后，RIPK3、AIF、p-JNK、IL-6蛋白表达均升高。侧脑室注射RIPK3选择性抑制剂GSK872和JNK特异抑制剂SP600125后明显降低了大鼠海马CA1神经元死亡数量，且RIP3、p-JNK和IL-6的蛋白表达降低。腺相关病毒过表达RIP3后大鼠海马CA1区神经元死亡更彻底，程序性坏死程度加重，且神经元炎症因子表达水平明显升高。通过免疫沉淀和免疫荧光染色提示RIP3和AIF在细胞质中形成新的复合物后向细胞核内位移。JNK特异性抑制剂SP600125不仅可以抑制p-JNK和IL-6的表达，还可抑制RIP3-AIF复合物的形成。.出血性卒中损伤后，小鼠出血周边水肿区域神经元亦呈现出程序性坏死的特征。出血损伤后RIP3、AIF、CaMKII蛋白表达均增加，且第12小时表达达到峰值。小鼠脑出血后神经功能缺损的行为学改变也在12至24小时最为明显。细胞核与细胞质蛋白做核质分离检测，RIP3 siRNA组细胞核和细胞质RIP3表达均下调；mPTP活性抑制剂CsA加CaMKII抑制剂KN-93能有效抑制损伤后AIF的上调。且在细胞质中，RIP3 siRNA组和CsA联合KN-93组均能抑制CAMKII的表达在RIP3 rAAV组，上调RIP3表达，胞浆中AIF和CaMKII表达均上调；细胞核中AIF表达也上调。损伤后AIF和RIP3与细胞核DAPI共定位，免疫荧光染色和免疫共沉淀证实使用RIP3 siRNA干预，可抑制RIP3-AIF复合物的形成。.神经元在受到损伤后AIF-RIP3合成及核转移是受到JNK信号通路的调控，以RIP3为中心的程序性坏死与炎症通路的共同作用。是促进神经缺血性或出血性损伤的重要机制。抑制RIP3和JNK可能是潜在的神经保护靶点，从而改善神经功能缺损。