基于光学新技术及单细胞分析研究苏云金芽孢杆菌芽孢萌发机理与异质性

Defining the biophysical pathways of cellular life and elucidating the function and its molecular mechanisms is one of the current great scientific challenges at the intersection of life and physical sciences. Bacillus thuringiensis (Bt) is a spore-forming bacterium and the most widely used bio-pesticides in the world. The process of spore germination is a crucial step of converting a dormant Bacillus spore into a vegetative bacterium. In this project, multiple-trap laser tweezers Raman spectroscopy, differential interference contrast (DIC) microscopy and fluorescence microscopy are used to analyse the real-time dynamic germination of hundreds of individual Bt spores, by monitoring the kinetics of Ca-dipicolinic acid (CaDPA) release, cortex hydrolysis and the changes of macromolecules in the spores' core of individual spores. Our cross-disciplinary research project attempts to determine: (i) the basic features and mechanisms of Bt spore germination triggered by nutrient germinants or non-nutrient germinants; (ii) the effect of physical and chemical agents on the Bt spores and spore germination，and its molecular mechanisms; and (iii) the heterogeneity of Bt spore germination and its mechanisms. The knowledge derived from this work will allow us to better understand the process of spore germination of Bt, to push the effect on Bt production and its use in farming, provide scientific help to develop new treatments to prevent and suppress the Bacillus in medicine and food industry as well. The results will also provide useful reference to single-cell analysis in biomedical field.

了解细胞生命活动途经并阐释其功能和分子机制是当前生命与物理科学交叉领域面临的重要科学挑战之一。苏云金芽孢杆菌（Bt）是目前应用最广泛的生物农药，而芽孢萌发是芽孢从休眠转向营养生长的关键起始。本项目应用多光镊单细胞拉曼光谱、多细胞实时DIC显微成像和实时荧光显微成像等光学新技术和单细胞分析方法来阐释Bt芽孢的萌发活动及其机制。通过实时监测和分析单个Bt芽孢萌发过程吡啶二羧酸钙释放、芽孢皮层溶解及孢内DNA、及蛋白质变化的实时动态信息，获知：（1）Bt芽孢营养萌发与非营养萌发的基本规律与机理；（2）物化因子对Bt芽孢及芽孢萌发的影响及其分子机制；（3）Bt芽孢萌发的异质性以及造成这种异质性的机理。项目通过创新技术和创新方法获知Bt芽孢的萌发特点及其异质性，为提高Bt制剂的生产和使用效率，也为医学和食品工业抑制和预防芽孢杆菌提供科学依据。项目成果也将为生物医学单细胞分析提供有益的借鉴。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是目前世界上生产规模最大、应用最广泛的微生物农药。我国是Bt制剂研究和应用大国。芽孢(Spore)是芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属细菌细胞为应对不良生长条件而在细胞内形成的休眠体。由于含水量很低且富含2，6－吡啶二羧酸（dipicolinic acid，DPA）与钙离子（Ca2+）的络合物CaDPA，芽孢对辐射、热、干燥、极端pH值、静水压和一些有毒化学物品等有很强的抵抗能力。芽孢对外界环境也很敏感，一旦感受到外部存在适宜萌发的条件，就开始萌发，恢复到营养细胞状态。芽孢萌发作为芽孢从休眠态向营养生长转变的关键起始，是认识芽孢抗性和了解各种灭菌措施或化学药剂杀灭细菌芽孢的机制的窗口。.本项目通过探索应用单细胞拉曼光谱、多细胞实时DIC显微成像等新兴的光学技术，结合单细胞分析方法，实时监测和分析单个Bt芽孢萌发过程CaDPA释放、芽孢皮层溶解及胞内其它物质变化的实时动态信息，获知：Bt芽孢的萌发规律；物理、化学因子及农药制剂对Bt芽孢萌发的影响及其分子机制；Bt芽孢萌发的异质性以及造成这种异质性的机理。结果发现：Bt芽孢萌发与其它芽孢杆菌属（Bacillus）芽孢有相似也有不同之处，肌苷和外源CaDPA可以极快地触发Bt芽孢萌发；不同培养条件的Bt芽孢、不同菌株、不同萌发剂触发的萌发都存在明显的异质性；不同的理化因子对与萌发相关的蛋白产生不同程度的影响；热激处理对Bt芽孢月桂胺萌发有显著的促进作用；芽孢萌发普遍存在一个共性事件——在CaDPA释放完成前都有一个1分钟左右的极速释放过程。项目成果对于有针对性地诱发Bt芽孢萌发，提高生物农药Bt的使用效率，提高Bt发酵效率以及更好地杀灭Bt芽孢有重要的指导意义，也为了解芽孢萌发的异质性、芽孢内膜的性质与功能提供了新的视角。项目成果也为抑制和预防医源、食物源芽孢杆菌提供了科学依据，为生物医学单细胞研究提供便利和借鉴。