心肌细胞损伤与保护时14-3-3η配体蛋白的差异蛋白质组学研究

本项目根据前人14-3-3必须通过与配体蛋白结合后，参与细胞内几乎所有磷酸化与细胞内亚定位等生命过程成果；在前期工作中发现并证实14-3-3η是内源性保护蛋白、与配体蛋白PKCε相互作用，帮助其向线粒体迁移，发挥心肌保护作用的，以及同时还存在其他可能配体蛋白的基础上，拟将TAP分离/2-D DIGE电泳/MALDI-TOF-MS分析/2-D磷酸化免疫印迹等技术有机结合，探讨14-3-3η在急性心肌损伤与保护时配体蛋白组学的差异性，利用生物信息学专用软件绘制14-3-3η配体蛋白组以及参与磷酸化的14-3-3η配体蛋白组的MAP图；选择一个典型的差异性高表达14-3-3η配体蛋白X，通过体外、细胞学实验以及RNA干扰沉默实验，确认其与14-3-3η的相互作用以及初步探讨急性心肌损伤与保护中的作用及其机制，为进一步阐明急性心肌损伤时细胞内的信号传递机制，寻找新的药物作用靶点奠定理论与实验基础。

本项目构建了pNTAP-B-14-3-3η重组质粒、转染至P19Cl6细胞，建立P19CL6 pNTAP/14-3-3η细胞株，14-3-3η 蛋白表达水平明显上调；完成了A/R处理相应细胞株中的2-DE及MALDI-TOF-MS实验；经对相关实验结果的筛选、分析与鉴定，发现并确认差异表达的配体蛋白有23种，其中16表达上调，7种表达下调；根据上述相关实验结果，绘制出了急性心肌细胞损伤与保护时14-3-3η配体蛋白质组学的MAP图；结合心肌损伤与保护的相关理论以及本实验室前期工作，所选择的典型差异性高表达14-3-3η配体蛋白X——是VDAC1；应用GST-pulldown、Co-IP以及双标记免疫荧光等技术，确认VDAC1与14-3-3η之间存在着相互作用；应用RNAi技术使14-3-3η低表达后，VDAC1调控细胞线粒体mPTP开闭的能力明显减弱，即ROS爆发、mPTP开放、大量Cyt C从线粒体间隙释放进入胞浆，大量细胞凋亡；本项目还完成了部分中药有效成分对14-3-3η表达影响的研究，首次发现槲皮素、辣椒素、葛根素、川芎嗪可不同程度上调原代培养的大鼠心肌细胞14-3-3η的表达，提高其对抗缺氧/复氧损伤的能力。本课题全面完成研究计划，并培养博士生2名，硕士生3名。