c-Kit受体在哺乳动物肠粘膜上皮细胞表达的生物学意义研究

It is well known that SCF/c-kit signaling plays essential roles for promoting growth, development, differentiation, migration, survival and cell death of hematopoietic stem cells, mast cells, germ cells, melanocytes and interstitial cells of Cajal. In our primary observation，we found that c-kit and its products, KIT protein, is highly expressed in the normal intestinal epithelium of mice and human, but its cell biological event is not fully understood. Therefore, this study aimed to: ① To determine the cell-types of the expression of the KIT protein in the intestinal epithelium by using c-kit gene point mutation mice with modern morphological and molecular biological methods; ② To investigate the role of KIT signaling in the renewal process of the intestinal epithelial cells with the methods including Brdu incorporation and Imatinb treatment with the related experimental techniques including laser micro-dissection,qRTPCR and Western blotting;③ To explore the changes of intestinal epithelial structure and function during the bacteremia and toxemia of mouse model by injecting E.coli and LPS respectively to the experimental animals; ④ To understand the pathophysiological significance of KIT expression in the intestinal epithelium in an animal model made by AOM and DSS feedings which the pathogenesis of the atypical hyperplasia - intestinal polyps - precancerous lesion - colorectal cancer of the mice intestinal epithelium would be carefully investigated. Clarifying the mechanisms could provide a new target for clinical treatment of the related diseases.

已知SCF/c-kit信号分子对造血干细胞等多种细胞的发育、迁移、存活和死亡等具有重要调控作用。本课题组对KIT定位研究发现正常小鼠肠粘膜上皮亦表达c-kit及其产物：KIT，但其生物学意义尚不清楚。因此本项目拟：①利用c-kit点突变小鼠模型，结合现代形态学和分子生物学研究方法，确定小鼠肠粘膜上皮表达KIT的细胞类型；②通过Brdu摄入和Imatinb抑制KIT活性，使用qRTPCR和Western结合显微激光切割等实验，明确KIT在肠上皮细胞更新过程中的调控作用与机制；③经小鼠阴茎背静脉注射E. Coli和LPS，分别制作菌/毒血症全身感染动物模型，研究KIT在维持肠上皮结构和功能完整性中的作用；④给予实验动物AOM和DSS药物，研究KIT在肠上皮非典型增生-肠息肉-癌前病变-结直肠癌等病变过程中的作用与机制，阐明KIT在肠粘膜上皮表达的病理生理意义，为临床相关疾病的治疗提供新靶点。

本项目为一年期的小额资助，主要进行了一些基础研究，在中国解剖学报、Cell Tissue Res.和 Histol Histopathol.杂志发表论著各1篇，在此基础上，获得了2014-2017年的面上项目资助，继续进行该课题的相关研究。.KIT广泛表达于造血祖细胞、肥大细胞、生殖细胞、黑色素细胞、Cajal间质细胞（ICCs）等，KIT与其配体，干细胞因子（SCF）结合后，对上述细胞的分裂、增殖、分化以及功能维持等具有重要调控作用。在胃肠壁内，除肥大细胞外，KIT主要存在ICCs，参与胃肠运动功能的调节，但胃肠黏膜上皮表达大量KIT的生物学意义尚不清楚。因此，本研究利用野生型C57/BL6小鼠（WT），c-kit基因功能缺失性点突变杂合子小鼠（Wadsm/+）和纯合子小鼠（Wadsm/m），经RT-PCR、免疫荧光染色和Western blot检测肠黏膜上皮细胞KIT的表达；BrdU掺入实验研究肠黏膜上皮细胞更新，探讨KIT受体信号分子在肠黏膜上皮细胞更新中的作用；应用酒精灌肠制作结肠黏膜损伤模型，结合BrdU掺入和HE染色等，比较野生型和杂合子小鼠结肠黏膜损伤修复差异，分析KIT信号分子在肠黏膜上皮损伤修复中的作用，为临床相关疾病的治疗提供新的实验依据。.主要结果：①肠黏膜上皮存在大量KIT阳性细胞，主要分布在肠隐窝的中下部，随肠黏膜上皮细胞分化成熟，KIT表达逐渐减弱至消失。②三组小鼠结肠黏膜形态无明显差异，隐窝的深度相近。③腹腔注射BrdU后，三种小鼠结肠黏膜上皮内均可见BrdU阳性细胞，主要位于隐窝中下段，但杂合子和纯合子小鼠BrdU阳性细胞数量较野生型小鼠明显减少。④酒精灌肠损伤结肠黏膜后，结肠隐窝塌陷，上皮完整性被破坏，黏膜固有层可见大量炎性细胞浸润，在杂合子小鼠肠黏膜损伤尤为严重；腹腔注射BrdU，24 h后野生型小鼠可见结肠隐窝部出现KIT和BrdU双标阳性的细胞，亦可见少量仅表达KIT或BrdU的细胞；而杂合子小鼠双标细胞数量较野生型小鼠明显少，提示肠黏膜上皮表达KIT与肠上皮更新有关，KIT表达减少或缺如，肠上皮更新和炎性损伤修复明显减慢。