秦皮滴眼液调控眼表淋巴增生治疗干眼症的机制研究

An important factor in the pathogenesis of dry eye disease is based on the immune inflammatory reaction.There are closely related to the pathological state of ocular surface inflammation and lymphatic system. At present there are experiments show the existence of lymphangiogenesis in dry eye, these new lymphatic vessels involved in the regulation of ocular surface inflammation dry eye damage. Qinpi eye drop, has anti-inflammatory effect, the efficacy of treatment of dry eye disease had verificed through clinical significantly, but the molecular mechanism is still unknown. We create the intelligent environment control system induced murine model of dry eye. LYVE-1 immunohistochemical and electron microscopic observate the new lymphangiogenesis. Using immunohistochemical method to observe the T cells (CD4+T) and inflammatory index analysis to indicate the relationship between lymphangiogenesis and inflammation. Detection of expression of VEGF-C, VEGFR-3 in each group to indicate that Qinpi eye drops regulate ocular surface inflammation and the influence degree of lymphatic function through VEGF-C/VEGFR-3, which provides a new way of pathogenesis mechanism of dry eye research and conformed the treatment effection of Qinpi eyedrops.

基于免疫的炎症反应是干眼病发病机制的重要因素。眼表炎症与淋巴系统的病理状态密切相关。目前有实验证明干眼病的眼表存在着新生淋巴管，这些新生淋巴管参与了干眼病眼表炎症损害。我院自制中药制剂――秦皮滴眼液，具有抗炎作用，经多年临床验证治疗干眼病功效显著，但目前分子机制及作用靶点不明。我们通过创建智能环境控制系统诱导的小鼠干眼模型，应用免疫组化 LYVE-1及电子显微镜观察眼表新生淋巴管的超微结构；检测T细胞(CD4+T) 及炎症指数，分析眼表新生淋巴管与炎症之间的关系；并在此基础上研究秦皮滴眼液对眼表VEGF-C表达、对淋巴的调控以及对眼表炎症程度的影响。对阐明眼表淋巴新生和功能改变是干眼症发病机制之一，以及秦皮滴眼液调控淋巴生成治疗干眼症的作用机制具有重要意义。从而为干眼发病机制研究及秦皮滴眼液治疗干眼的机制研究提供一个新的思路与途径。

课题组建立一套单纯环境因素诱导的小鼠干眼模型系统，从泪液分泌量、角膜荧光素染色和评分、泪液羊齿状实验、组织学检测结果（角膜HE+结膜PAS）等 5 项指标进行观察，说明该模型能较好地模拟处于干燥环境中人类泪膜及眼表发生的改变。通过免疫组化LYVE-1及电子显微镜观察眼表新生淋巴管的超微结构，证实了干眼发病过程中角膜新生淋巴管的存在，而不伴随血管新生。通过免疫荧光和Western blot和Real-time PCR从蛋白水平、基因水平对VEGF-C和它的受体VEGFR-3进行定量分析检测，结果发现随着VEGF-C、VEGFR-3表达水平的增加，淋巴管新生的区域面积及管径均相应扩增，由此可以说明VEGF-C/VEGFR-3信号通路与淋巴管新生是紧密相联。通过ELISA的方法检测发现干燥应力引起眼表IL-1β、IL-6促炎细胞因子高水平表达及CD4＋T细胞浸润增加，而抗炎细胞因子TGF-β1、IL-10低水平表达。秦皮滴眼液可以通过抑制VEGF-C/VEGFR-3信号通路的激活及降低VEGF-C、VEGFR-3转录水平，降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6的表达及增加抗炎细胞因子TGF-β1、IL-10表达水平，减轻CD4＋T细胞浸润情况，从而抑制和减轻由于干眼引起的淋巴管新生和眼表炎症、角膜上皮的病变。本实验，我们研究了干眼发病过程中角膜淋巴管新生的情况，同时讨论了干眼角膜新生淋巴管的病理生理意义及其与炎症之间关系，以及秦皮滴眼液抗淋巴管生成治疗干眼的分子调控机理和潜力。干眼疾病的淋巴管新生研究是一个新兴的领域，这可能形成全新的针对眼表疾病的淋巴系统治疗方法的基础，今后我们对于眼表新生淋巴管的调控机制的还需要进一步深入研究。