热纤梭菌纤维小体的产物抑制机理及工程改造

Cellulosome, nature's most effective cellulose degrading molecular machine, suffers serious product inhibition, which hampers its industrial application. The central theme of this proposal focuses on the core bottle-necks of employing cellulosome for enzymatic lignocellulose hydrolysis via Consolidated Bio-Processing route. The research plan consists of three parts: the protein engineering of individual key enzymes, the construction and optimization of designer cellulosome, and the genetic manipulation of cellulosome system of Clostridium thermocellum. Firstly, the structure detail and the product inhibition mechanism of a thermostable beta-glucosidase Bgl21 and a cellobiohydrolase Cel48S of Clostridium thermocellum will be analyzed by structure comparison and molecular simulation, which will then guide the protein engineering to alleviate the product inhibition effect of glucose and cellubiose. Secondly, we will construct and analyze a series of designer cellulosomes in order to obtain information for constructing an optimal cellulosome with enzymatic kinetic balance, and tolerant to high substrate loading and high product concentration. Finally, Clostridium thermocellum strain DSM1313 will be genetically converted into a designer cellulosome producer. This work will pave the road for the industrial application of cellulosome in lignocellulose-based bioenergy and bio-based chemicals.

纤维小体是自然界中最高效的纤维素降解分子机器，强产物抑制效应是其产业化应用的主要障碍之一。本项目围绕纤维小体应用于木质纤维素的整合生物加工糖化的核心瓶颈，分别从酶组分的蛋白质工程改良、纤维小体的体外设计/优化、热纤梭菌的纤维小体系统的遗传改造三个层次开展研究：首先以外切酶Cel48S及β-葡萄糖苷酶Bgl21为对象，通过结构比较及分子模拟计算，解析产物抑制的分子机理及构效关系，利用蛋白质理性设计缓解纤维二糖或葡萄糖的产物抑制效应；其次，设计及构建人工纤维小体，重点优化Cel48S及Bgl21的催化结构域的距离及剂量配比，获得酶组分间催化动力学平衡、底物载量高，葡萄糖终浓度大的纤维小体改良方案，最后，对热纤梭菌DSM1313菌株进行遗传改造，将其打造成改良纤维小体的全菌催化剂平台，解决纤维小体的规模化制备瓶颈，为纤维小体在纤维素基生物能源及生物基化学品方面的工业化应用奠定必要的理论基础。

大量可再生木质纤维素类生物质资源的清洁、高效、低成本降解利用是加快发展农村循环经济，保障国家粮食及能源安全和环保减排的一项重要战略任务。但是，目前缺少清洁、高效、低成本的木质纤维素生物糖化关键技术，导致转化效率和成本尚不能适应大规模工业化生产要求。本项目重点围绕纤维小体应用于木质纤维素糖化的核心瓶颈，从整合生物加工（CBP）的工艺要求出发，通盘考虑，分别从单个酶组分的蛋白质工程改良、纤维小体的体外设计/优化、热纤梭菌的纤维小体系统的遗传改造三个层次及角度开展研究，分阶段解决产物抑制、催化动力学平衡、及低成本制备的关键瓶颈问题。取得的主要成果如下：.1）以热纤梭菌DSM1313菌株的关键外切酶Cel48S为重点对象，通过解析其晶体结构及分子模拟计算分析，设计并表达纯化了一系列理性设计突变体，其中D490A，E76A，D520A，R643A，G655V，Q355L的Cel48S突变体均表现出比野生型更低的反馈抑制效应，其中以E76A的解除反馈抑制作用最为显著；.2），设计及构建了一系列人工纤维小体，重点优化外切酶Cel48S及β-葡萄糖苷酶Bgl的催化结构域的距离及剂量配比，筛选及整合新型类膨胀因子元件，最终确定了以外切酶-Bgl融合表达为核心的催化动力学平衡、底物载量高，葡萄糖终浓度大的纤维小体改良方案；.3）对热纤梭菌DSM1313菌株进行理性遗传改造，构建了第一代及第二代全菌催化糖化工程菌株，以微晶纤维素为底物，糖化效率比野生型分别提高了2倍及2.5倍，显著提高了糖化效率。最后，以预处理麦秆为底物，构建及优化了完整的秸秆全菌催化糖化工艺流程，纤维素转化率大于90%，初步具备中试放大条件。.4）发表SCI论文9篇，申请发明专利10项，其中已授权2项。.本研究将为纤维小体在木质纤维素基生物能源及生物基化学品方面的工业化应用奠定必要的理论基础。