体外重构细菌肽聚糖单体合成途径的基础研究

Biosynthetic pathway of cell wall plays an important role in identifying antibacterial targets. More than 40 antimicrobial were developed based on traditional methods, however, many multi-drug resistant bacterium were found in the clinical application. Based on the expression of all functional enzymes of peptidoglycan pathway, this project aims to co-expresse 6 soluble proteins and 2 membrane proteins in cell-free system functionally and simultaneously. We establish a new model to screen anti-resistant antibiotics and focus on the interaction between two membrane proteins in this pathway. This research not only generates new breeding method on screening anti-resistant antibiotics, but also accelerates understanding the mechanism of peptidoglycan biosynthesis.

细菌细胞壁肽聚糖的生物合成途径是抗生素研发的重要药物靶标，采用传统的筛选方法已经开发出四十多种抗菌药物，但是在临床应用后均出现了多重耐药性菌株。本课题在前期单一功能性表达细菌肽聚糖单体合成途径的8个组成酶的基础上，通过自主构建和优化大肠杆菌无细胞表达体系，首次实现肽聚糖单体合成途径的6个可溶性蛋白和2个膜蛋白在一个无细胞体系中同时功能性表达，深入研究膜蛋白MurG转移酶与MraY转位酶的细胞定位及相互作用。整合自动化检测平台，从组合酶学角度构建一个抗耐药性的抗菌分子筛选新模型。这一工作既能建立高通量筛选抗耐药性抗生素的新方法，又能为深入研究肽聚糖合成机制奠定坚实的理论基础和技术源头。

随着抗生素的滥用，细菌不断进化获得耐药性，成为超级细菌。筛选针对细菌关键药物靶点蛋白的新型抗菌物质必须跟上抗生素耐药性发展。虽然针对细菌细胞壁肽聚糖生物合成途径的胞质酶开发出多个抗菌化合物，但是以合成途径的膜蛋白以及整条合成途径为靶标开发抗菌物质依然比较困难。本课题通过构建和优化大肠杆菌无细胞表达体系，在体外重构细菌细胞壁肽聚糖单体合成途径。系统地研究了常见致病菌百日咳杆菌、幽门螺杆菌、肺炎衣原体、伯氏疏螺旋体以及模式菌大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的细胞壁肽聚糖合成途径的限速酶MraY转位酶的酶学性质，发现来源于革兰阴性菌的MraY转位酶结构的正确折叠需要一个相对稳定的磷脂纳米盘形成的疏水环境，革兰阳性菌MraY转位酶在表面活性剂构成胶束中就具有较高的酶活。通过功能性地合成MraY转位酶磷脂纳米盘复合体和细胞基质蛋白MurA-MurF以及外周膜蛋白MurG，在体外成功重建完整的细菌细胞壁肽聚糖单体合成途径，作为新型高效的抗菌药物筛选平台。通过加入已知的抑制剂磷霉素、feglymycin与衣霉素等验证了筛选平台的有效性。在上述工作的基础上，采用无细胞蛋白表达系统合成MraY转位酶抑制剂内在膜蛋白噬菌体174蛋白，成功地解决限制深入研究内在膜蛋白E的瓶颈问题。研究了催化细菌细胞壁肽聚糖合成途径起始底物UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成的药物靶标酰基转移酶GlmU的酶促反应动力学参数和反应条件，发现枯草芽孢杆菌GlmU酶具有较低的葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶活性。计算机模拟枯草芽孢杆菌GlmU蛋白质结构以及与底物分子结合，定点突变活性中心氨基酸进行验证，为深入研究其酶促反应机制以及后续研发新型高效的抗菌药物打下基础。