井冈霉烯胺生物合成途径的重构

Valienamine is pseudoamino-sugar analogs of D-glucose, which has a-glucosidase inhibitory activity. and its derivatives have been found to be key components for biological activities in pseudo-aminosugars and pseudo- oligosaccharides. Therefore, valienamine is one of the most important chemical intermediates for the production of glucosidase inhibitors, which are potential to be medicines.Voglibose,for example, has been used in Diabetic Patents since 1994..Microbial degradation of validamycin to produce valienamine refers to at least 13 genes,which occur complicated pathway and byproducts.The gene cluster for validamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus 5008 has been cloned and a number of the proteins involved have been characterized,resulting in biosynthetic pathway to Valienone(ValA，ValD，ValK),which is poroposed to be transformed to valienamine through an aminotransferase in vitro synthetic biology design.Through screening and rational design evolution for the heterogeny aminotransferase,we plan to built an efficient biosynthetic pathway of valienamine and banlance the modular control over metabolic fulux in vitro.

井冈霉烯胺是假氨基糖类水解酶抑制剂的核心结构，在糖尿病及相关疾病治疗中具有重要作用。目前应用两步微生物发酵法（涉及1３个基因）的复杂途径来制备井冈霉烯胺，生产效率低，亟待应用生物学新技术建立新的高效合成途径。本项目依据合成生物学设计理念，在Streptomyces hygroscopicus 5008中井冈霉素合成途径中ValA、ValD、ValK三个催化元件合成井冈霉烯酮的基础上，引入异源（如Bacillus circulans等）氨基转移酶，建立井冈霉烯胺合成的多酶耦合体系；通过酶分子改造，提高井冈霉烯胺的合成效率；并探讨各催化元件的体外协同作用。本研究的开展，不仅将构建新的井冈霉烯胺生物合成途径，还将丰富合成生物学在天然化合物合成领域应用的理论和实践。

C7N 氨基环醇类化合物三羟基环己烷或环己烯骨架上有一个羟甲基，结构与天然吡啶糖结构相似，可以被糖代谢过程中能量储备、信号传导、物质转运等代谢途径中的酶识别，因而具有重要的生物学特性。.β-valienamine 不饱和环己烯骨架上有R-氨基，是井冈霉素结构中 α-糖苷酶抑制剂前体 valienamine 的1-差向异构体。与 β-葡萄糖 C1 到 C4 拥有相同的立体构型，可作为 β-糖苷酶抑制剂开发的先导化合物，应用于由β-糖苷酶功能相关代谢疾病的药物开发。其衍生物 N-辛烷基-β-valienamine（NOV）和 N-辛烷基-4-epi-β-valienamine（NOEV）可以作为药物分子伴侣治疗由β-糖苷酶功能异常导致的 GM1-神经节苷脂贮积症、Morquio B 症以及 Gaucher 症等溶酶体贮积症（lysosomal storage disease, LSD）。由于其分子结构中具有多个手性中心，化学全合成较为困难，获得的一般为 β-valienamine 和 valienamine 的消旋产物。.本研究应用合成生物学理念，系统地分析了目标产物与微生物次级代谢产物结构的相似性、异源微生物酶催化反应的立体选择性及催化效率、微生物天然产物合成途径的模块性，以及合成代谢多途径的竞争性等特点。以吸水链霉菌井冈霉素生物合成途径中间产物井冈霉烯酮为起始化合物，引入高度立体选择性的芽孢杆菌氨基转移酶（产物光学纯度 > 99.9 %）基因，并通过代谢工程手段敲除相关酶基因以阻断竞争途径，将异源氨基转移酶与井冈霉素生物合成途径进行了耦合，获得了发酵培养96小时可产生20 mg/L β-井冈霉烯胺的突变菌株。所构建的新的生物合成途径不仅解决了原有化学合成方法步骤多、安全性低等问题，更重要的是对“非天然产物”药物在微生物中生物合成进行了有益尝试。本研究还助于阐明生物体中复杂酶及代谢途径等模块组装合理性、有效性等合成生物学基础理论问题。.研究成果 De Novo Biosynthesis of β-Valienamine in Engineered Streptomyces hygroscopicus 5008 发表在国际合成生物学领域知名期刊-美国化学联合会合成生物学（ACS synthetic biology）上。