根皮素抑菌构效关系及对单增李斯特菌细胞膜功能的影响机制研究

Phloretin is a typical representative of the flavone chalcones, which has wide antimicrobial spectrum on foodborne pathogenic bacteria such as Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium，etc. The bacteriostatic activity of phloretin is closely related with four of its phenol hydroxyl, two benzene ring and carbonyl group. Preliminary study found that antibacterial activity of phloretin decreased when 7-OH was substituted. When 5-OH was substituted by glycoside (phloridizin), the bacteriostatic activity completely lost. Based on this, this research employed chemical modification to investigate antibacterial structure-activity relationship of phloretin. Etherification was used in 4’-OH and 9-OH, sulphonation in benzene ring, and carbonyl condensation in the carbanyl group of phloretin. Bacteriostatic effect of each substitution product was evaluated, respectively, then the antibacterial structure-activity relationship and synergistic effect of the three functional groups were discussed. Listeria monocytogenes was used as a research object to investigate the antibacterial mechanism of phloretin. Bacteria cell membrane integrity was examined using atomic force microscope, transmission electron microscopy (SEM), cell lysis rate and ATP leakage study. Membrane permeability was studied by determination of nutrient solution conductivity, intracellular K+ leakage and nucleic acid leakage (A260nm). Membrane fluidity was examined by the fluorescence polarization method, and membrane potential was test using the membrane fluorescent probe Disc 3(5) analysis. Antibacterial mechanism of phloretin preliminary clarified from the above four aspects. The research results of this study will provide direct theoretical support for application of phloretin as a natural bacteriostatic agent.

根皮素为具有广谱抑菌性的二氢查尔酮类物质，对食源性致病菌如单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌等具有较强抑菌能力。前期研究发现根皮素抑菌性与其分子中7位-OH及5-OH均有密切正相关，但其分子中其余官能团对抑菌性的贡献及抑菌机理尚不明确。基于此，本项目拟对根皮素分子三种官能团分别进行修饰：对4’-OH及9-OH醚化、苯环磺化、羰基缩合，评价各产物的抑菌效果，探明抑菌活性基团，并考察各官能团之间的协同作用，对根皮素抑菌构效关系进行探讨。以单增李斯特菌为对象，采用原子力显微镜、透射电镜及细胞裂解率和ATP泄漏考察细胞膜完整性，测定培养液电导率、胞内K+泄漏、核酸泄漏对膜通透性进行研究，通过荧光偏振法考察膜流动性，细胞膜荧光探针Disc3(5)分析膜电势，从以上四个方面研究根皮素对单增李斯特菌细胞膜的影响机制，探明抑菌机理。研究结果将为二氢查耳酮类物质作为天然抑菌剂应用提供直接理论支持。

本项目对根皮素抑菌构效关系及根皮素对单增李斯特菌细胞膜功能进行了研究，并对根皮素对单增李斯特菌生物膜形成及群感效应影响因子进行了探讨。以根皮素为母体，利用化学修饰方法对根皮素母体内各官能团进行结构修饰，获得了7种根皮素衍生物（根皮胺乙基醚﹑根皮素异烟肼﹑4'-氯根皮素﹑4'-硝基根皮素﹑5-丁氧基根皮素﹑7 -丁氧基根皮素和羰基还原根皮素），与根皮素及根皮苷共9种化合物进行结构分析研究，并结合抑菌试验研究结果，用经典的Free-Wilson 分别以各化合物对四种试验菌的log 1/MIC为因变量，以根皮素各官能团(5-OH, 7-OH, 4'-OH, 4-C=O)以及衍生化引入的各取代基为自变量，采用多元线性回归方法计算出各取代基的抑菌活性贡献值。计算结果表明根皮素母体结构中的4-C=O，5-OH，7-OH对其抑菌性能得影响较为显著，而4'-OH的抑菌活性贡献则明显较弱。.根皮素对单增李斯特菌细胞膜功能研究发现，根皮素能引起单增李斯特菌细胞膜通透性发生改变，造成细胞内钾离子大量外泄，但实验表明胞内大分子物质如DNA及蛋白质并没有外泄，说明根皮素对单增李斯特菌细胞膜只造成了微小损伤，并未改变细胞膜及细胞壁的完整性。项目组通过进一步研究对根皮素与DNA体外作用实验、ATP含量泄露测定实验、蛋白谱带分析实验表明，根皮素对单增李斯特菌菌体蛋白质的合成有明显的抑制作用。抑菌机理可能是通过引起细胞内遗传物质的聚集，从而影响相关基因的转录翻译，影响了胞内某些蛋白酶的含量，使细胞内能量合成受到影响，进而引起菌体细胞内的新陈代谢紊乱，最终导致菌体不能维持正常的生命活动而裂解死亡。另外，项目组通过进一步研究发现，根皮素对单增李斯特菌生物膜具有较强的抑制作用，在最大抑制率为60%。经20 μg/mL根皮素处理后，单增李斯特菌生物膜的粘附和聚集能力、保护能力受损、生物膜生成厚度均大幅减少。且根皮素抑制了群体感应相关基因—Agr系统基因的表达，使得其相对转录本水平降低了50%。.该项目研究结果对单增李斯特菌抑菌机理及防控提供一定的借鉴，同时也对根皮素以及同类型结构的天然产物抑菌构效关系研究打下了研究基础。...