ARHI与p53交联网络对口腔癌程序化细胞死亡的调控机制研究

程序化细胞死亡包括凋亡和自噬两种类型，在不同的基因表达条件下可能相互关联，自噬可能拮抗或延迟细胞凋亡，两者亦可能作为彼此的后备机制执行不可逆性细胞死亡的指令。口腔癌的治疗反应与程序化细胞死亡密切相关。我们的前期研究对P53基因在口腔癌恶性演进过程中的凋亡诱导作用及其分子机制已进行较为深入的探讨，但目前国内外对恶性肿瘤细胞自噬的研究尚处于起步状态。ARHI基因诱导的自噬性细胞死亡在肿瘤的发生发展中起着促进和抑制的双重作用，与环境压力下的癌细胞休眠保护密切相关,其在口腔癌中的相关研究中罕有报道。本课题以自噬相关的ARHI基因和凋亡相关的p53基因作为突破口，应用基因转染与沉默、蛋白芯片、免疫共沉淀等多种现代分子生物学技术，探讨舌癌细胞程序性死亡中ARHI及p53基因对关键通路PI3K-Akt-mTOR的调控机制，以期更深入解释舌癌细胞程序性死亡的整体调控过程，对分子靶向治疗具有重要理论意义。

研究背景：口腔癌是严重威胁人类健康的疾病之一，探索其恶性生物学行为及关键分子事件成为目前研究的热点。P53基因作为重要的“看守基因”，可调控关键分子通路，促进恶性肿瘤细胞凋亡；ARHI可调控恶性肿瘤细胞的自噬，从而促使细胞向程序化死亡方向发展。P53和ARHI基因作为程序化细胞死亡的关键基因，是否存在交互作用，其调控作用的分子机制需要深入研究。研究方向：本项目从P53和ARHI基因入手，在舌癌细胞系Cal-27中采用基因转染技术增强其表达，进而评价凋亡和自噬水平；同时研究P53和ARHI基因的相互作用；探索这两个基因对关键通路PI3K-Akt的调节作用，并进一步研究其下游功能蛋白的表达，分析P53和ARHI基因在口腔癌中的调控机制；最后通过构建动物模型，验证细胞实验结果。研究结果：采用腺病毒载体构建及转染，可显著提高P53及ARHI基因在舌癌细胞系Cal-27中的表达水平，其相应的下游蛋白bcl-2，bax，p21，stat3亦出现相应变化；值得注意的是ARHI基因转染可提高P53基因的表达，但P53基因转染未见明显的ARHI表达变化，ARHI可能是P53的一种上游调节因子。在细胞转染后48小时，可观察到程序化细胞死亡表现，细胞增殖活性明显下降；采用流式细胞术和TUNEL检测，可见Cal-27细胞凋亡水平明显升高，而通过透射电镜观察并对自噬关键蛋白LC3的研究表明，在P53和ARHI转染后，Cal-27细胞的自噬过程被启动，但整个自噬过程在下游被阻断，细胞进入程序化死亡。对PI3K-Akt通路的研究可见，通路关键因子Akt在Thr308和Ser473位点的磷酸化在基因转染后被抑制，从而抑制其下游因子4E-BP1的磷酸化，使eIF4E功能失活，进而引起其下游功能蛋白cmyc,Cyclin D1,bcl-2,FGF,VEGF,EGFR的表达降低，从而抑制Cal-27细胞的恶性表型。通过动物实验，我们验证了细胞实验的结果，可见在P53和ARHI基因治疗后，肿瘤原发灶的生长曲线显著降低。结论：本项目结果显示P53及ARHI基因可以通过抑制PI3K-Akt通路中关键因子的磷酸化，从而抑制恶性相关功能蛋白的表达，同时抑制细胞自噬，促进细胞凋亡，发挥其抗肿瘤作用。本研究深入研究了P53和ARHI基因在口腔癌中的调控作用机制，为恶性肿瘤的治疗提供了新的分子靶点。