肺炎链球菌新的转铁蛋白SPD_1609的发现及其功能研究

Iron is essential for bacterial survival and infection, but free ferrous ion (Fe2+) is extremely poorly available in host, bacteria have thus evolved high-affinity iron-uptake ABC systems to capture iron from transferrin (TF), haem-bound proteins or no-haem bound ferritin in the host. Iron-uptake ABC systems are highly conserved in Streptococci, consisting of lipoprotein, ATP-binding protein and hydrophobic transmembrane protein. Moreover, the lipoprotein is exposed to extracellular wall and thus may act as potential targets of drugs or vaccine candidates in preventing bacterial infections and diseases. Currently, interference with bacterial iron metabolism has been a hotspot of antibacterial strategy. In the present study, we found a novel iron-transporting protein SPD-1609 by using proteomics coupled with translatomics techniques. Based on our solid research background, this proposal aims to comprehensively study the biological function and metal-binding properties of SPD_1609 protein in Streptococcus pneumoniae by using molecular biology, cell biology, microbiology, biochemistry and animal experiment methods. Moreover, we will evaluate the immunogenicity and immunity protective effect of SPD_1609 protein in mouse as a vaccine candidate of S. pneumoniae. We believe that the results derived from this project will provide the theoretical basis for the development of new vaccines and anti-bacterial drugs targeting on the iron transport proteins.

铁是绝大多数细菌生存和形成感染的必需元素，但是宿主环境中游离存在的铁离子非常有限，所以细菌进化出了对铁离子具有高度亲和力的铁摄取系统，这些系统中的脂蛋白可直接从宿主细胞的含铁蛋白中掠夺铁离子。由于铁摄取系统在链球菌中具有高度的保守性，且脂蛋白暴露在细胞膜外，可以成为这些细菌引发的感染性疾病的疫苗候选物和药靶。干扰细菌铁代谢是目前抗菌研究的热点。我们发现在肺炎链球菌中除了已知的三个铁转运系统之外，还存在其他铁转运系统，并利用蛋白质组学和翻译组学方法，筛选到一个新的转铁脂蛋白SPD_1609。本研究拟在前期基础上，综合利用分子生物学、细胞生物学、微生物学、生物化学和动物实验等手段全面研究SPD_1609蛋白在肺炎链球菌中的金属结合/释放特性和生物学功能，同时在小鼠体内评价SPD_1609蛋白作为肺炎链球菌疫苗候选物的免疫原性和免疫保护效果，为开发基于转铁蛋白的疫苗和抗菌药物提供重要的理论基础。

铁是绝大多数细菌生存和形成感染的必需元素，但是宿主环境中游离存在的铁离子非常有限，所以细菌进化出了对铁离子具有高度亲和力的铁摄取系统，这些系统中的脂蛋白可直接从宿主细胞的含铁蛋白中掠夺铁离子。由于铁摄取系统在链球菌中具有高度的保守性，且脂蛋白暴露在细胞膜外，可以成为这些细菌引发的感染性疾病的疫苗候选物和药靶。本项目我们利用蛋白质组学和翻译组学方法，筛选到一个新的转铁脂蛋白SPD_1609。为了研究SPD_1609的生物学功能，我们首先原核表达纯化了SPD_1609蛋白，并用其免疫小鼠制备SPD_1609蛋白的多克隆抗体。接着我们成功构建了1609-缺失突变株和1609互补菌株，发现在铁限制培养条件下，与野生型肺炎链球菌相比，1609-缺失突变株中Fe含量显著降低，且生长变慢；细胞和动物实验结果显示缺失spd_1609基因不但显著降低肺炎链球菌对宿主细胞粘附和侵袭能力，而且显著降低肺炎链球菌在小鼠菌血症感染模型中的毒力，提高小鼠的存活率。此外我们利用荧光光谱在体外表征SPD_1609蛋白与不同铁源（Fe2+、Fe3+、hemin、ferrichrome）的结合情况，结果显示SPD_1609蛋白与Fe3+、hemin和ferrichrome的结合能力比较强，与Fe2+几乎不结合。最后，我们利用SPD_1609蛋白免疫小鼠，经过三次免疫后，小鼠血清中IgG抗体效价高达1:312500-1:1562500，且SPD_1609蛋白免疫组的细胞因子IL-4和1L-10均显著高于对照组，表明SPD_1609蛋白具有较强的免疫原性，能够激起较强的体液免疫应答；此外与对照组相比，SPD_1609蛋白免疫组小鼠的脾细胞增殖指数显著升高，表明SPD_1609蛋白能诱导机体快速有效地产生免疫应答用于抵抗抗原的再次感染。本研究为开发基于转铁蛋白的疫苗和抗菌药物提供重要的理论基础。