基于Cap-seq和PARE-seq的纤细病毒抓帽机制及其病理学意义解析

Many segmented negative-sense RNA viruses threat the health of human and livestock and affect food stability. These viruses share a mechanism called cap-snatching in which they cleave host RNAs with a virus-encoded endonuclease activity and use the capped RNA fragment to prime transcription of their own mRNAs. Indentifying host RNAs that are cleaved and used by viruses is key to understand the mechanisms and pathological implications of cap-snatching. However, this remains challenging until present. Two newly developed technologies named Cap-seq and PARE-seq provided new avenue to solve this problem. Tenuiviruses constitute an important group of plant-infecting, segmented, negative-sense RNA virus. In this study, Cap-seq and PARE-seq will be employed to identify host RNAs snatched or cleaved by two tenuiviruses. The data will be used to study the donor selectivity in cap-snatching of the two tenuiviruses Rice stripe virus (RSV) and Rice grassy stunt virus (RGSV). Besides, host RNAs specifically cleaved by each virus will be identified and the role of cleaving these RNAs in viral pathogenicity will be studied using reverse genetic technologies. The results of this study will deepen our understanding of the mechanisms underlying tenuivirus infection, which will be useful in designing novel antiviral strategies. In addition, the results may also be helpful to scientists focusing on related viruses.

多种分段负义RNA病毒威胁人畜健康或粮食安全。该类病毒普遍采取抓帽机制，切割含帽子结构的寄主RNA，以帽子序列为引物进行自身mRNA的转录。明确病毒切割利用了哪些寄主RNA是解析抓帽机制和其病理学意义的关键，但受技术手段限制，这一点一直无法实现。新近发展成熟的Cap-seq和PARE-seq技术为突破这一瓶颈提供了可能。纤细病毒是一类重要的植物分段负义RNA病毒，本项目拟结合Cap-seq和PARE-seq技术，鉴定两种纤细病毒水稻条纹病毒和水稻草矮病毒侵染过程中切割和利用的寄主RNA，分析它们对帽子供体的选择性及其分子基础；鉴定两种病毒特异切割的寄主RNA，研究病毒切割对这些RNA积累水平的影响，并结合两种病毒症状学上的差异，通过反向遗传学手段研究切割这些RNA在病毒致病中的作用。所得结果有助于认识纤细病毒侵染机理，为该类病毒的防控提供理论指导，也对相关病毒研究有借鉴价值。

帽子结构在真核生物mRNA的稳定和翻译等过程中起重要作用。除非有一些替代机制，病毒也需给自身mRNA添加帽子结构。为实现这一目的，分段负义RNA病毒普遍采用抓帽机制，即它们在合成mRNA时，从帽子结构下游10-20个碱基处切割寄主mRNA，利用5'端切割产物（帽子序列）作为自身模板链的转录引物，使每条病毒mRNA都含一小段来源于寄主mRNA的帽子序列。作为侵染周期中的关键步骤，深入认识抓帽机制对开发抗病毒策略具有重要意义。. 纤细病毒是一类植物分段负义RNA病毒，其中的水稻条纹病毒（Rice stripe tenuivirus, RSV）和水稻草矮病毒（Rice grassy stunt tenuivirus, RGSV）严重威胁我国粮食安全。然而，研究者对纤细病毒抓帽的细节还不清楚。本研究提出并验证了下面一个基本模型：纤细病毒从帽子结构下游11-19（主要是11-13）个碱基处的A或C后切割寄主mRNA，所得帽子序列m7G---A与病毒模板链3'端的U1或U3配对，而m7G---C可以与病毒模板链3'端的G2或G4配对。配对发生后，病毒按照模板链的序列延伸帽子序列。一些情况下，新延伸的帽子序列从模板链脱离。病毒可重新利用这些帽子序列，但需一种被称为引发与重配的机制，使帽子序列新延伸出的碱基与模板链重新配对。纤细病毒几乎可从所有寄主mRNA抓帽，但从编码叶绿体蛋白或核糖体蛋白mRNA抓帽的频率明星比从其它mRNA抓帽的频率高。另外，不同纤细病毒使用引发与重配的频率不同，RSV转录毒义链和负义链时使用该机制的频率也不同。. 通过抓帽，病毒把寄主mRNA的帽子序列都“悬挂”到了自身mRNA的5'端。测取单个病毒mRNA的帽子序列谱，可获得寄主细胞内所有mRNA的5'端序列。本项目探讨了这一现象的利用价值：以双生病毒与RSV共侵染本氏烟，将RSV的帽子序列Map到双生病毒基因组，得到了一个精细的双生病毒转录起始位点图谱。. 综上，本研究阐明了纤细病毒抓帽的基本步骤，为进一步解析其机制奠定了重要基础，也拓展了我们对植物布尼亚病毒抓帽机制的认识。另外，本研究首次探讨了抓帽机制作为一种工具在分子生物学研究上的应用。