家蚕转录因子BmPOUM2基因启动子高级结构的功能分析

DNA molecules in cells usually exist in the form of linear double-stranded helix with A-T and G-C base pairs. However, it has been found recently that when runs of guanines or cytosines are presented in the chains of DNA or RNA, the secondary structures of G-guadruplex (G4) or i-motif can form. These structures are believed to play critical important roles for epigenetic regulation of telomeric DNA protection, DNA replication, gene transcription and mRNA protein stranslation. We for the first time found that the promoter of transcription factor BmPOUM2 in Bombyx mori contains potential G4 structure. This project will study the advanced structure of G4 and i-motif in the promoter of the transcriptiion factor BmPOUM2 in the silkworm by the appoaches of molecular biology, cell biology, development biology and bioinfomatics. The contents of the study include :1) Identification of the advanced structure of the promoter of BmPOUM2; 2) Molecular and Biochemical charaters of the advanced structure of the promoter of BmPOUM2; 3) Regulatory proteins of the advanced structure of the promoter of BmPOUM2; 4) Biological functions of the advanced structure of the promoter of BmPOUM2; and 5）Systemic evolution and biological significance of the advanced structure of the promoter of BmPOUM2. The study will provide a novel molecular mechanism of the regulation of gene transcription, which is significantly important for our understanding the mechanism of gene regulation in organisms.

生物DNA分子通常以A-T和G-C碱基配对的线性双螺旋形式而存在。但是，近年来发现DNA或RNA链上多个鸟嘌呤（G）或胞嘧啶（C）的重复出现可分别形成G-quadruplex（G4）或i-motif的二级结构，这些结构对于端粒DNA保护、DNA复制、基因转录及mRNA蛋白翻译等过程的表观遗传调控起着十分重要的作用。我们首次发现家蚕转录因子BmPOUM2基因启动子上具有可能的G4结构。项目将采用分子生物学、细胞生物学、发育生物学和生物信息学等方法，研究家蚕BmPOUM2启动子G4和i-motif高级结构的结构与功能。研究内容包括：1）BmPOUM2启动子高级结构的鉴定；2）该高级结构的分子和理化特征；3）该高级结构的调控蛋白；4）该高级结构的生物学功能；5）该高级结构的系统进化及生物学意义。研究将提出基因转录调控的一种全新的分子机制，对于深入认识生物基因调控机理具有重要的科学意义。

DNA G4和i-motif结构是近年来备受关注的2种DNA高级结构，我们前期研究发现在家蚕转录因子POUM2基因的启动子上可能存在G4和i-motif结构。本项目进一步围绕POUM2启动子上G4和i-motif结构的功能展开研究。按照项目书计划开展了高级结构的鉴定、高级结构结合蛋白的鉴定、高级结构的调控功能和高级结构的进化特征等一系列研究，实现了预期目标。取得的主要成果如下：1）明确了POUM2启动子上G4和i-motif结构形成的具体序列和位置（-94~-120），G4结构存在于正链，i-motif结构存在于负链。2）通过碱基突变、互补链干扰（ASO）和小分子化合物处理等方法破坏G4和i-motif结构后，POUM2启动子的转录活性显著降低，表明二者参与了POUM2基因的转录。3）鉴定到一个特异结合i-motif结构的蛋白ILF和一个特异结合G4结构的LARK蛋白。4）通过改变ILF或LARK的蛋白表达水平，可以显著改变POUM2基因的转录水平。表明这两个DNA高级结构结合蛋白分别通过结合G4和i-motif结构参与了对POUM2基因转录的调控。5）综合以上结果，我们提出了DNA高级结构是一种新的基因表观遗传调控机制的学术观点。研究成果在Nucleic Acids Research（2篇）、Communications Biology、Epigenetics & Chromatin、Insect Science和蚕业科学等国内外杂志发表。通过该项目培养了博士后1名、博士研究生3名、硕士研究生6名。项目主持人多次应邀在国内外重要学术会议上做大会报告。组织和主持了国内DNA高级结构专门的学术研讨会。本研究的意义在于：1）首次在昆虫中通过实验方法证明了G4和i-motif结构在细胞核内的存在；2）提出了DNA 高级结构是一种新的表观遗传调控机制的学术观点；3）为研发新型靶向DNA高级结构及其结合蛋白的小分子药物提供理论指导。