斜纹夜蛾固醇运转蛋白的结构与功能研究

胆固醇是细胞膜的组成成分，是昆虫蜕皮激素生物合成的前体。但昆虫体内缺少合成胆固醇所必需的关键酶，所以不能自主地合成胆固醇，而必须吸收植物甾醇并转化为体内胆固醇来满足生长、发育和繁殖的需要。固醇转运蛋白（SCP）是运输胆固醇及脂肪酸酯的转运蛋白。斜纹夜蛾是分布于热带和亚热带的世界性重要农业害虫。项目将从5个方面对斜纹夜蛾固醇转运蛋白SlSCPx基因和蛋白开展研究：1）SlSCPx基因的表达调控、mRNA和蛋白剪切的方式；2）SlSCPx表达与胆固醇吸收和蜕皮激素变化的关系；3）SlSCPx蛋白的亚细胞定位；4）SlSCPx蛋白与底物结合特性；5）SlSCPx蛋白的结构与功能关系。对斜纹夜蛾固醇转运蛋白功能及结构与功能关系的分析，将有助于认识胆固醇对蜕皮激素的生物合成、脂类信号传导和对昆虫生长发育的影响，对以胆固醇转运蛋白为害虫防治分子靶标研发高效安全专一的新型杀虫剂具有重要的理论和应用意义。

胆固醇不仅是构成细胞膜的主要成分，而且也是蜕皮激素的前体，并参与各种生理活动。昆虫由于缺乏合成胆固醇需要的关键的鲨稀合酶和羊毛甾醇合酶，故不能自身合成胆固醇，只能从宿主植物中吸收。固醇转运蛋白（Sterol Carrier Protein）是参与胆固醇吸收和转运的一个重要蛋白。在本项目中，我们对编码该蛋白的基因Slscpx的表达调控，对蜕皮激素和保幼激素的响应，以及该蛋白在斜纹夜蛾中肠细胞中的定位进行了深入的研究。研究发现，该基因启动子的一个反应元件可以与中肠细胞两个核蛋白进行结合，从而调控了该基因的表达。该基因在离体的细胞中显然不受蜕皮激素和保幼激素的诱导表达，但在前胸腺中，受到蜕皮激素和胆固醇的诱导表达。Slscpx所编码的两个蛋白SLSCP-2和SLSCP-t定位于细胞的过氧化物酶体中。以人类SCP-2样蛋白为模板，模拟了SlSCPx-2的三维结构，虚拟筛选与蛋白结合的脂肪酸和胆固醇并采用ANS荧光替换实验进行体外验证实验, 结果表明， SlSCPx-2纯化蛋白对胆固醇，硬脂酸，油酸，软脂酸，亚油酸，豆甾醇，花生四烯酸具有不同程度的结合亲和力，暗示SlSCPx-2蛋白在胆固醇和脂肪酸吸收和转运中起着非常重要的作用。点突变实验结果表明，F53, W66, F89, F110, I115, T128 and Q131是底物与蛋白结合中的关键氨基酸。进一步的虚拟筛选获得5种抑制剂分子并进行了体外结合实验和生物学实验，结果表明， AH-487/41731687, AG-664/14117324，AG-205/36813059 和AG-205/07775053可以抑制斜纹夜蛾幼虫的正常生长发育。