艳山姜调控HMGB1-NF-κB级联通路逆转血管内皮间质转化机制研究

Based on the preliminary discovery that Alpinia zerumbet regulates vascular endothelial function and endothelium-dependent correlation, focusing on the key point in Endothelial-to-mesenchymal transition （Endo-MT）, we propose the hypothesis that ethnicmedicine Alpinia zerumbet inhibits Endo-MT through the regulation of HMGB1-NF-κB signal pathway. In this study, we applied TGF-β-induced Endo-MT cell injury model, and built endothelial injury in spontaneously hypertensive rat animal model. Utilizing GC-MS fingerprints and other modern analytical methods, along with cell electron microscopy morphological analysis, and modern molecular biology techniquessuch as biochemical enzymatic and PCR, western blot, we systemmatically analyzed essential oil from Alpinia zerumbet’s function of reversing Endo-MT and its protective effect vascular endothelial function. This study provides insights and scientific basis to the use and further systematical research and development of Alpinia zerumbet resource, which promotes the advance of ethnic medicine on treating cardiovascular diseases, and also provides guidance to the clinic trials.

前期研究发现，艳山姜挥发油具有保护血管内皮作用以及抑制血管重构的作用，而血管内皮间质转化（Endo-MT）是介导内皮功能障碍与血管重构的关键病理环节。本研究提出基于调控关键通路HMGB1-NF-κB可能是艳山姜逆转内皮间质转化的关键分子机制假说。研究应用TGF-β建立Endo-MT细胞损伤模型，建立自发性高血压大鼠血管Endo-MT动物模型，采用GC-MS等分析手段，运用细胞电镜、免疫组化等进行形态学分析，相关生化酶学及PCR、Western blot等现代分子生物学技术，系统分析艳山姜挥发油逆转血管内皮间质转化作用，进一步揭示其靶向保护血管内皮的作用机制。本研究为艳山姜民族特色药物资源的挖掘与开发提供科学依据，为民族医药防治心血管疾病提供理论基础，指导临床。

目的：分析艳山姜挥发油（EOFAZ）抑制TGF-β1诱导HUVEC内皮间质转分化（EndMT）及高脂饲料诱导自发性高血压大鼠（SHR）胸主动脉EndMT的作用，并基于HMGB1-NF-κB进一步分析艳山姜逆转EndMT的关键分子信号。方法：①体外培养HUVECs，采用TGF-β1（10 ng/mL，72h）诱导建立EndMT的细胞模型。EOFAZ在造模前预给药2 h，再加入TGF-β1共孵育复制EndMT细胞模型。细胞免疫荧光染色观察内皮标志物内皮细胞钙黏素（VE-cadherin）及间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达；扫描电镜分析细胞器损伤；流式细胞仪分析细胞周期；划痕实验分析细胞迁移能力；划痕免疫荧光染色法观察划痕区域细胞标志物的表达；生化酶学法分析上清液相关细胞因子的含量水平； RT-PCR及Western blot分析各组细胞相关信号的表达。②高脂饲料诱导建立SHR大鼠内皮损伤EndMT实验动物模型，实验分组为正常对照组（Ctrl.）、模型组、EOFAZ组（20 g/kg）。HE、Massopn染色观察胸主动脉血管形态；生化酶学法分析相关细胞因子的含量水平；免疫荧光技术分析血管条VE-vacadherin和Snail的表达；心脏指数及左心室肥厚指数；PCR及western blot技术分析相关信号的表达。结果：①EOFAZ干预给药后，能够上调TGF-β1诱导的内皮细胞VE-cadherin及下调α-SMA、Snail的表达水平，同时降低细胞的迁移能力；同时改善细胞器损伤；抑制细胞DNA合成S期；明显增加培养上清液NO，降低ET-1、IL-8、TNF-a、VEGF、AngII的水平。②EOFAZ抑制SHR大鼠血管EndMT标志物表达；明显增加大鼠血清NO，降低ET-1、IL-8、TNF-α、VEGF、AngII的水平；改善大鼠心指数及肥厚指数。细胞实验与动物实验结果均显示，EOFAZ给药后能够上调内皮细胞及SHR大鼠血管VE-cadherin的表达，降低α-SMA、Snail、HMGB1、RAGE、TLR2/4、Smad2、MMP-2的mRNA及蛋白表达，并抑制NF-кB p-p65及MAPK信号的磷酸化水平。③结论：EOFAZ抑制血管内皮间质转化，靶向保护血管内皮，其机制与调控HMGB1-NF-κB信号及干预相关炎性因子相关。