a-酮戊二酸调节水稻根部铵同化的靶标己糖激酶鉴定与响应机制研究

水稻是我国重要的粮食作物，也是典型的铵氮营养植物，铵同化水平是影响其生长发育和产量的重要因素。我们在前期工作中观察到a－酮戊二酸可促进水稻根部铵同化，并证明该作用依赖于己糖激酶活性。本项目拟以三叶期水稻为材料在同工酶水平上揭示上述调节效应的靶标己糖激酶，并探讨其作用机制。在水稻铵氮营养液中添加a－酮戊二酸，通过检测根部己糖激酶同工酶活性和转录水平的变化鉴定靶标酶；克隆表达并分离纯化靶标同工酶，等温滴定微量热分析a－酮戊二酸与该己糖激酶的作用关系；原位免疫印迹鉴定该靶标酶在根部的组织定位；克隆水稻根部a－酮戊二酸信号受体蛋白（PⅡ）基因，构建过量表达PⅡ的基因工程酵母菌，揭示该信号蛋白在a-酮戊二酸调节中的功能。本项目研究营养生长期水稻非光合组织铵同化相关代谢调控，力图阐明a－酮戊二酸调节铵同化的己糖激酶靶标与作用机制，为实现水稻高效利用铵氮营养提供理论依据。

a－酮戊二酸（a-KG）是植物铵同化必需的碳架化合物，同时具有代谢调节功能。揭示a-KG调节水稻根部铵同化的靶标己糖激酶对于深入认识禾本科作物氮同化碳氮代谢协调机制有重要意义。本项目研究揭示：（1）三叶期水稻根部表达两类共7种OsHXK同工酶，其表达均被a-KG促进。（2）丙氨酸促进水稻根部铵同化的幅度显著高于硫酸铵；水稻幼苗氮饥饿后施以丙氨酸，其根部铵同化相关C/N代谢酶活性和代谢物含量升高幅度更大；N-乙酰葡萄糖胺（NAG）抑制HXK活性和靶标OsHXK表达，丙氨酸效应削弱，证明该效应依赖于根部HXK控制的a-KG合成；a-KG介导的靶标酶OsHXK5和OsHXK6以及OsGlnB（OsPII）蛋白的表达调节是关键因素。（3）克隆了靶标酶OsHXK5和OsHXK6的全长cDNA，生物信息学预测跨膜区和亚细胞定位信号，原位免疫印迹鉴定其亚细胞定位为线粒体和细胞核；以E.coli Rosette plus为宿主表达了四种截短蛋白；以毕赤酵母GS115为宿主表达了OsHXK5和OsHXK6全长蛋白；包涵体纯化获得靶标酶抗原，免疫新西兰兔，抗血清纯化制备相应多克隆抗体；亲和色谱分离纯化OsHXK5和OsHXK6全长或截短蛋白；上述靶标OsHXK同工酶活性均被NAG、2-脱氧葡萄糖或3-羟甲基葡萄糖竞争性抑制；酶动力学分析结合等温滴定证明a-KG能提高酸性介质中OsHXK6或OsHXK5全长或截短蛋白的己糖亲和力。（4）克隆表达了水稻根部a-KG信号转导蛋白OsPII，亲和色谱分离纯化制备电泳纯蛋白，免疫新西兰兔制备多克隆抗体，分子模拟结合等温滴定证明OsPII与a-KG可在ATP存在下相互作用。（5）过量表达OsHXK6可提高酿酒酵母铵同化能力；过量表达OsPII可提高酿酒酵母在a-KG存在下的铵同化能力。本项目研究证明水稻根部OsHXK5和OsHXK6是a-KG调节铵同化的靶标HXK同工酶，揭示了a-KG或丙氨酸促进三叶期水稻根部铵同化的代谢机制。本项目研究已发表（含接受）研究论文6篇，其中SCI研究论文2篇（Journal of Microbiology, 2014, 52(9): 762-770, doi: 10.1007/s12275-014-4112-2; Plos One, 已接收, doi: 10.1371/journal.pone.0117115）。