嗜热梭菌β-1,3半乳聚糖外切酶的结构与多糖水解机制研究

Since the limited availability of traditional fossil fuel is not compatible with the economy growth in the 21th century, innovation of new energy sources becomes a challenge to the whole world. Cellulose composes about 50% of dry biomass. It is the most important carbon source in our ecosystem. Cellulosome, a type of enzyme complexes from microorganisms degrades cellulose to industrially usable material including biofuel and, therefore, becomes a subject of intensive studies. Ct1,3Gal43A is an exo-β-1,3-galactanase from Clostridium thermocellum, a thermophilic bacterium. It is a typical cellulose degradation enzyme and an important component of the cellulosome. It catalyzes degradation of cellulose inter-chain carbohydrates to produce galactose. Recently, our laboratory has successfully crystallized and solved the structure of Ct1,3Gal43A. We propose to further determine complexes structures of Ct1,3Gal43A with a variety of potential substrates and/or substrate analogs. Combined with molecular biology, biochemistry, and protein engineering techniques, we plan to unveil the enzymatic catalytic mechanism and molecular basis of substrate specificity and to engineer new functions into this enzyme to improve its catalytic power and functional diversity in cellulose digestion.

在经济迅速发展的今天，传统能源日益匮乏，新能源的开发要求日益迫切，而纤维素作为生物界最重要的碳源物质，占全球光合作用产生的植物干重的二分之一；因此，对降解纤维素的纤维素小体和各种纤维素酶的研究逐渐成为各国竞相开展的焦点。来自嗜热梭菌的β-1,3半乳聚糖外切酶Ct1,3Gal43A是一个典型的纤维素小体纤维素酶亚基。它可以通过外切的方式把难于降解的和广泛存在的β-1,3半乳聚糖水解成半乳糖。本项目在实验室成功解析Ct1,3Gal43A晶体结构的基础上，以X射线晶体学、分子生物学、生物化学、蛋白质工程等手段，进一步解析Ct1,3Gal43A与其底物和/或底物类似物的复合物晶体结构，揭示β-1,3 半乳聚糖外切酶在原子水平的催化机理，拓宽多糖水解的机制研究，通过改善目标酶的天然属性，使其成为可在生物能源再利用中的一个新的高效的工程酶。

纤维素作为生物界最重要的碳源物质和新能源物质之一，在传统能源日益匮乏的今天，逐渐成为各国竞相开展的焦点。来自嗜热梭菌的β-1,3半乳聚糖外切酶Ct1,3Gal43A是一个典型的纤维素小体纤维素酶亚基。它可以通过外切的方式把难于降解的和广泛存在的β-1,3半乳聚糖纤维素水解成可以被利用的成分半乳糖。因此具有较高的经济价值和研究价值。 本项目在实验室成功解析Ct1,3Gal43A晶体结构的基础上，以X射线晶体学、分子生物学、生物化学等手段，通过蛋白热稳定性实验和等温热量滴定法测定不同底物包括半乳糖、乳糖、IPTG、β-1,3半乳二聚糖、β-1,3半乳三聚糖等与蛋白的结合能力筛选-1,3半乳聚糖外切酶的最适底物。进一步解析了Ct1,3Gal43A与其底物和/或底物类似物的复合物晶体结构，揭示β-1,3 半乳聚糖外切酶在原子水平的催化机理，拓宽多糖水解的机制研究，为之后的蛋白质工程改造奠定了基础。本项目首次对嗜热梭菌的β-1,3半乳聚糖外切酶（Ct1,3Gal43A）的结构和功能进行研究，对其结构解析一方面可以丰富糖苷酶家族成员的研究内容，揭示其发挥作用的分子基础，另一方面也具有重要的实际应用价值，可以通过对其蛋白质进行的工程改造为纤维素的生物降解提供一个新的潜在的高效工程酶，促使生物能源的循环利用，满足日益增长的能源需求。. 在完成此课题的基础上，我们又对另一个重要的致病菌羊布鲁士杆菌的MTAN 的蛋白晶体结构进行解析， MTAN蛋白催化两种底物MTA (5′-Methylthioadenosine) 和SAH (S-adenosylhomocysteine) 的不可逆的分解反应。MTAN蛋白在生物甲基化、多胺生物合成、甲硫氨酸循环以及细菌群体感应这些新陈代谢过程中起着非常重要的作用。由于MTAN蛋白在哺乳类动物的体内是缺乏的，因此是潜在的重要的药物研发的靶标。通过对不同底物的的结构研究和酶活实验，我们确定了参与反应的关键氨基酸，其中Tyr134和Met144这两个位点的突变引起Km值的大幅增加，而Glu18、Glu145和Asp168这三个活性位点的突变引起酶活的完全丧失。在此基础上，我们对BmMTAN蛋白可能的酶活机制及基于结构生物学的药物研发进行了探讨。