利用单分子FRET研究CXCR1的构象受底物及信号分子的调控

G protein coupled receptors (GPCRs) sense molecules outside of cell and activate inside signal transduction pathways and cellular responses. There is a growing body of evidence that GPCRs exist an ensembles of discrete conformations that can be influenced by ligands and lipids. Crystal structures of GPCRs in active or inactive conformations provide high-resolution insights into GPCR activation. But these crystal structures are static snapshots and lack the essential dynamics of conformational heterogeneity after the binding of ligands and downstream signal molecules such as G protein and arrestin. Single molecule FRET (smFRET) detects at single-molecule level and opens up new opportunities to probe the detailed kinetics behind ensemble averaging. We will use smFRET method to study the impact of ligands and downstream signaling molecules on the equilibrium distribution of the conformational states of the CXCR1. CXCL8 (also known as IL-8) exists as monomers and dimers and they differentially activate and regulate CXCR1. Will IL-8 variants differentially alter the equilibrium distribution of the conformational states of CXCR1? The strategy we propose will provide direct information about the kinetics of activation of CXCR1 and this information will be vital for understanding the molecular mechanism of GPCR signaling.

G蛋白偶联受体（GPCR）在维系细胞生命的各个方面起着重要的信号传导作用。大量研究表明GPCR具有多种构象，这些构象的分布受不同配体及膜环境的调控。由于晶体结构只是GPCR几个构象的快照，人们尚不清楚配体及下游信号分子（如G蛋白、arrestin）如何调节GPCR在不同构象之间动态转换。为了研究GPCR多个构象的分布在信号传导过程中的变化，我们将采用单分子FRET的方法，以趋化因子受体CXCR1作为模式蛋白，检测CXCR1在结合配体前、结合配体后以及下游信号分子结合后不同构象的分布及调控。同时，CXCL8(IL-8)单体及二聚体对CXCR1具有不同的亲和力及下游信号传导强度,它们可能稳定不同的CXCR1构象分布。通过以上研究，提供CXCR1在配体及下游信号分子结合过程中动态的结构信息，为GPCR信号传导的机理研究提供理论基础。

细菌的耐药性系指细菌对某些抗菌药物产生的耐受性，是当今威胁全球人类健康的主要隐患之一。细菌通常都可利用多种方法来躲避抗生素和其他有害物质的毒害作用，其中最基本的方法就是利用细胞膜上的多药物抗性蛋白（MDR transporter）将体内的抗生素排出体外。MsbA蛋白是革兰氏阴性细菌体内的、与人源P-gp蛋白同源的一类ABC转运蛋白，主要作用是将两亲性的底物如LPS的前体从细菌内膜的胞内侧转运到周质腔侧。到目前为止，MsbA蛋白已经有多种构象的结构被报道，但有关其在脂环境中转运过程中的构象变化机制仍然存在争议。因此，在本课题中，我们利用单分子荧光共振能量转移技术来研究MsbA蛋白在去污剂、脂质体和纳米盘这三种不同环境中的构象之间的差异以及MsbA蛋白在ATP水解循环过程中的构象在这三种环境中分别是如何变化的。通过smFRET实验，我们初步认为MsbA蛋白在三种不同环境中其构象分布具有很大的差异；MdfA 蛋白属于 Major Facilitator Superfamily，该家族蛋白是一类普遍存在于细菌和哺乳动物细胞中的次级转运蛋白，该家族蛋白主要利用细胞膜两侧的质子或钠离子跨膜电化学势作为驱动力对底物进行跨膜转运。MdfA 蛋白主要利用质子跨膜电化学势转运多种药物分子，既包括电中性底物又包括带电荷底物，例如氯霉素，甲枫霉素，溴化乙锭，四苯鏻等。本文我们利用单分子荧光共振能量转移技术（smFRET）研究了 MdfA 蛋白在不同 pH，不同底物条件下的动态构象。我们发现 MdfA 蛋白在 apo 状态下主要存在两种构象分别是内向开口和外向开口。不同的底物对蛋白的构象有不同的影响，电中性底物氯霉素和甲枫霉素将蛋白更倾向于稳定在内向开口构象，正电荷底物四苯鏻更倾向于将蛋白稳定在外向开口构象。不同底物对蛋白的动态性影响不同，四苯鏻可以加快蛋白两种 构象的相互转变。我们的单分子实验为研究多药物转运蛋白的转运机制提供了新的实验证据。