雄激素受体下游因子circRNA-FNTA通过亲本基因影响膀胱癌侵袭与顺铂化疗敏感性的作用及机制研究

Bladder cancer (BCa) is one of the most common urinary malignancies. Preventing invasion/ metastasis and improving chemotherapy efficacy are vital for the treatment of BCa. Using strategies of GEO microarray screening and bioinformatics analysis, we previously found several androgen receptor (AR) regulated circRNAs, and identified circFNTA (hsa_circ_0084171) promoted BCa invasion and cisplatin chemoresistance. Mechanism dissection revealed that circFNTA could act as a ceRNA to compete with miR-370-3p, which target the host gene FNTA. Accordingly, we hypothesize AR/circRNA-FNTA/miR-370-3p/FNTA signaling alter the BCa cell invasion and cisplatin chemosensitivity. Using methods such as circRNA overexpression and knockdown, FISH, CHIP, Dual luciferase, mice xenograft model, we try to confirm our hypothesis in vitro, in vivo as well as in clinical studies. We aim to elucidate the mechanisms and provide new strategies for BCa progression and chemoresistance at circRNA level.

膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，防止肿瘤向深部浸润和远处转移并提高其化疗效果是治疗的关键。申请人前期通过GEO芯片筛选与生物信息学分析，发现了系列雄激素受体AR调控的差异circRNAs，并鉴定出了circRNA-FNTA具有调节膀胱癌细胞侵袭和顺铂敏感性的双重作用。初步机制发现，circRNA-FNTA可能通过ceRNA机制竞争miR-370-3p影响亲本基因FNTA表达。据此，申请人提出设想：AR/circRNA-FNTA/miR-370-3p/FNTA通路调控了膀胱肿瘤侵袭过程与顺铂化疗效果。本课题拟采用circRNA过表达及稳定剔除、原位杂交、染色质共沉淀、双荧光素酶报告基因、裸鼠体内成瘤等方法，从体外、体内及临床多角度证实circRNA-FNTA参与膀胱癌进展的功能并探究调控机制，希望在“circRNA”层面阐释膀胱癌进展及化疗耐药的作用机制，从而为膀胱癌精准治疗提供新思路。

背景：膀胱癌是最常见的泌尿系恶性肿瘤之一，具有高复发、易进展和转移、化疗耐药等特点，防止或减少肿瘤向深部浸润和远处转移，并提高其化疗效果是膀胱癌治疗的关键。目的:我们拟研究雄激素受体 AR 下游 circRNA 因子 circFNTA 在膀胱癌细胞中的表达情况以及其对膀胱癌细胞侵袭能力和顺铂化疗敏感性的影响。方法：在 GEO 数据库中选取膀胱癌与癌旁组织中差异表达的系列 circRNAs。采用膀胱癌细胞系 J82 和 UMUC3，通过过表达与敲减 circRNA 策略， RT-qPCR 探寻受 AR 调控的 circRNAs。采用Transwell， MTT 研究侵袭与顺铂化疗敏感性表型。进一步，通过 qPCR与荧光原位杂交（FISH）分别测定膀胱癌临床标本中 circRNA 的表II达。生物信息学预测分析、 RNA pull-down、 q-PCR、 western blot、染色质免疫共沉淀（ChIP）、双荧光素酶报告基因等方法，研究 circFNTA上游及其下游靶基因通路。并且，通过裸鼠皮下成瘤和鼠尾静脉转移瘤模型，在体内验证敲减 circFNTA 引起的膀胱癌抑制作用。结果：我们鉴定出一个新的功能性的circRNA(hsa_circ_0084171)，命名为 circFNTA，在膀胱癌组织和细胞中高表达。机制分析揭示 AR 可通过直接结合 RNA 编辑基因 ADAR2 的 5'启动子区，进而抑制 ADAR2 以增加 circFNTA 表达。功能及机制实验发现， circFNTA 可作为 ceRNA 与 miR-370-3p 竞争宿主基因 FNTA信使 RNA 的 3’ UTR 区域，增加 FNTA 蛋白表达进而激活下游 k-Ras信号，从而调控膀胱癌细胞侵袭和顺铂化疗敏感性。体内动物实验研究也证实，靶向 circFNTA 可抑制膀胱癌细胞侵袭能力，并增强其对顺铂药物的肿瘤抑制效果。结论： circFNTA 为受 AR 调控的下游因子， 具有促进膀胱癌细胞侵袭能力和调节顺铂化疗敏感性的能力。 靶向此 AR/ADAR2/circFNTA/miR-370-3p/FNTA/k-Ras 信号通路可能帮助我们更好地抑制膀胱癌侵袭和顺铂化疗耐药。本项目为发掘更多的膀胱癌临床预测因子与药物治疗靶点打下基础。