CIK细胞和肿瘤特异性增殖腺病毒共同介导p21Ras单链抗体治疗恶性肿瘤的实验研究

Targeted therapy holds a great orientation for treatment of malignaices. Previously, supported by the National Natural Science Foundation, we constructed a single chain fragment variable(ScFv) against p21ras, which could be used for gene therapy of tumors induced by ras mutation or overexpression. However, its clinical application is limited by short duration of gene expression, poor treatment safety and constraints on delivery. Based on our preliminary research, this proposal aims to explore the synergistic anti-tumor effect of cytokine-induced killer cells(CIKs) and genetically-modified wild-type human adenovirus serotype 5 (Ad5) expressing the ScFv against p21ras. Briefly, in this proposal, we will reconstruct Ad5 to carry gene of ScFv against p21ras and to replicate specifically in tumor cells, and then employ CIKs as a carrier of adenovirus, finally carry out a series of experiments in vivo and vitro on the combined anti-tumor effect. Our proposal will achieve a targeted delivery and release of adnoviurs vectors using CIKs carrier, long-term expression of ScFv against p21ras by modifying Ad5 to specifically replicate in tumor cells, and treatment safety through combining tumor-homing CIKs with tumor specifically-relpicated adenovirus. It will provide a new targeted therapy technique for ras-related tumors by fully taking advantage of the triple anti-tumor effect of CIKs , tumor specically-replicated adenovirus and ScFv against p21ras.

靶向治疗是恶性肿瘤治疗的重要方向。我们在国家自然科学基金的资助下（30872994）构建了可用于靶向治疗Ras基因相关肿瘤的抗p21Ras单链抗体，但其表达时长、安全性和给药途径的局限性限制了在临床上应用。本课题拟在前期研究基础上，用基因工程技术对野生型Ad5腺病毒载体进行改造，构建携带p21Ras单链抗体基因的肿瘤特异性增殖腺病毒，装载于CIK细胞中，开展恶性肿瘤治疗的实验研究。本课题以CIK细胞作为细胞载体实现腺病毒载体的靶向运输和靶向释放，利用肿瘤特异性增殖腺病毒在肿瘤细胞内的特异复制实现p21Ras单链抗体的长效表达，利用CIK细胞的肿瘤归巢性和肿瘤特异性增殖腺病毒在正常细胞中不复制的特性提高治疗安全，充分利用CIK细胞、肿瘤特异性增殖腺病毒和p21Ras单链抗体各自的抗肿瘤活性协同提高治疗效果，为Ras相关肿瘤的靶向治疗提供新的方法。

本项目于2015年1月起实施，2018年12月完成。主要研究内容与结果：（1）将野生型5型腺病毒的E1A、E1B启动子替换为肿瘤特异性启动子，构建了重组腺病毒KGHV200，通过病毒在细胞内的增殖实验证实KGHV200只在肿瘤细胞中特异性复制增殖，而在正常细胞中不复制增殖。（2）用35型腺病毒的纤毛基因替换了KGHV200的纤毛基因，构建了重组腺病毒KGHV400，通过荧光及电镜观察，证实KGHV400能够有效感染CIK细胞。（3）将实验室前期构建的抗p21Ras单链抗体插入到重组腺病毒的基因组中，最终构建了能够在肿瘤细胞内特异性复制增殖并且可以感染CIK细胞，同时还能够在肿瘤细胞中长效表达抗p21Ras单链抗体的重组腺病毒抗KGHV500。（4）选取乳腺癌细胞系MDA-MB-231、结肠癌细胞系SW480、胃癌细胞系SGC-7901、肺癌细胞系A549、脑胶质瘤细胞系U251、肝癌细胞系Huh7通过细胞杀伤实验、细胞划痕实验、细胞迁移实验及细胞凋亡实验证实KGHV500在体外能够有效的抑制上述肿瘤细胞的生物学活性。（5）以上述六种人肿瘤细胞系建立裸鼠移植瘤模型进行体内抗肿瘤实验，发现CIK+KGHV500能够显著抑制裸鼠移植瘤的生长。病理研究显示，CIK细胞能将KGHV500成功运送到肿瘤部位，并在肿瘤细胞中表达抗p21Ras单链抗体，而正常组织除脾脏外均未发现腺病毒的存在，并且也没有发生形态学变化，表明CIK+KGHV500治疗裸鼠移植瘤具有安全性。项目严格按照任务计划书执行，完成了所有研究内容，达到了预期研究目标。.研究内容发表相关学术论文9篇，其中SCI 7篇，中文核心2篇。培养硕士研究生8名，全部顺利毕业，完成全部预期研究结果。本项目共获资助47万，目前合计支出38.7万，其中材料费23万，测试费3.2万，差旅费1.2万，出版费2.6万，劳务费6.3万，管理费2.35万。所以支出全部严格按照经费预算书执行。剩余经费8.3万，剩余经费将用于本项目后续研究支出。