蛋白C系统在溃疡性结肠炎血栓形成中的作用及机制研究

Hypercoagulable state and thrombosis are leading lethal causes of ulcerate colitis (UC).Our previous research revealed that protein C (PC)system was inhibited in dextran sulfate sodium (DSS)-induced UC mouse, while the mechanism involved remained unknown. Recent studies demonstrate the key role of β-arrestin pathway in regulating different mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal pathways in the pathology of UC; in addition, our research found the infiltration of a large number of plasma cells, and macrophages in the inflammatory colon, and p38 MAPK expression was up-regulated, the pro-inflammatory cytokines levels were increased as well. Consequently, we speculate plasma cells—immunocomplex—macrophages—cytokines—β-arrestin-MAPK pathway involved in regulating the changes of PC system related to UC. The aim of the present study is to further isolate and identify colonic plasma cells, macrophages and microvascular endothelial cells of DSS-induced UC mouse, and to analyze their interactions in the pathology of UC by means of flow cytometry technique to confirm our hypothesis. Moreover, we study the molecular signal mechanism by antagonizing MAPK pathways to provide the theoretical basis and the experimental basis for UC treatment.

血液高凝状态、血栓形成是导致溃疡性结肠炎（UC）恶化、患者死亡的主要原因。本课题组前期研究发现，蛋白C（PC）系统在硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的UC小鼠被抑制，但机制尚不清楚。近来研究提示：β抑制蛋白（β-arrestin）信号通路在UC中发挥重要作用，对不同的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路进行调节；同时我们预实验发现，UC小鼠结肠组织大量浆细胞、巨噬细胞浸润，p38 MAPK表达上调，血清促炎细胞因子水平升高，因此，我们推测，浆细胞—免疫复合物—巨噬细胞—细胞因子—β-arrestin-MAPK这一信号通路在UC小鼠PC系统改变中起重要作用。本项目拟进一步采用DSS模型，分离鉴定结肠组织浆细胞、巨噬细胞、微血管内皮细胞，并通过流式细胞术等技术分析其在UC发病中的相互作用，证实我们的研究假说，在此基础上，研究阻断MAPK信号途径对其影响，阐明参与其中的分子信号机制，为UC治疗提供理论依据和实验基础。

蛋白C系统（PCS）调节功能失衡可能是溃疡性结肠炎（UC）发病机制之一，但其在UC中变化的具体机制尚不明确。本课题首先复制UC模型进行炎症程度评估，并与PCS进行相关性分析，同时检测β-arrestin及MAPK通路的变化。发现UC小鼠大体、组织学积分均明显升高，浆细胞、巨噬细胞增多，免疫复合物Ig G-IC表达上调，血浆促炎细胞因子水平升高；PCS成分蛋白C（PC）、蛋白S（PS）活性均明显降低，同时内皮细胞蛋白C受体（EPCR）表达下调；相关性分析表明，UC小鼠血浆PC活性与炎症程度呈负相关；且结肠组织β-arrestin、pJNK MAPK、pP38 MAPK在基因和蛋白水平表达均明显上调。从而在整体水平初步证实UC时PCS被抑制。.为阐明PCS抑制的机制，分离小鼠结肠黏膜固有层浆细胞，鉴定后检测各类浆细胞数量；发现与体内实验黏膜固有层Ig G-IC水平升高的结果相一致，UC小鼠结肠粘膜Ig G型浆细胞明显多于对照组，表明参与UC发病的浆细胞以Ig G型为主。.分离结肠巨噬细胞，发现UC小鼠巨噬细胞明显增多，且以CD14+CD64+型为主；用模拟的Ig G-IC刺激正常巨噬细胞，发现其表达TNF-α、IL-6的水平比对照组明显升高。.进一步分离、培养结肠黏膜微血管内皮细胞（MVECs），观察TNF-α或IL-6刺激后MVECs中PCS成分及β-arrestin、MAPK通路的变化；发现刺激后MVECs的PCS成分被抑制，表现为APC活性降低，EPCR或TM表达水平下调，且TNF-α或IL-6诱导的EPCR表达下调被P38 MAPK抑制剂、JNK MAPK抑制剂逆转；同时，TNF-α或IL-6诱导MVECs表达β-arrestin、P38 MAPK、JNK MAPK的能力明显升高。. 综上，UC时Ig G型浆细胞增加，并通过形成Ig G-IC，作用于CD14+CD64+巨噬细胞分泌促炎细胞因子，进而改变MVECs功能，抑制PCS，其中β-arrestin-P38 MAPK/JNK MAPK信号通路起关键作用。这些结果为UC治疗提供了理论依据和实验基础。.项目资助发表SCI论文1篇，核心论文8篇，待发表SCI论文1篇。联合培养硕士生2名，目前均在读。项目投入经费30万元，支出29.9928万元，剩余经费0.0072万元，计划用于本项目研究后续支出。.