CXCR4在溃疡性结肠炎小鼠蛋白C系统变化中的作用和机制研究

Microvascular endothelial cells are most important non-immune cells involved in ulcerative colitis (UC), while protein C (PC) system is critical to the mediation of function of vascular endothelial, and plays an important role in the regulation of intestinal homeostasis. Our previous research have found that PC system is suppressed in dextran sulfate sodium (DSS)-induced UC mice, and the mechanism involved signaling pathway of plasma cells -immune complexes -macrophages -chemokines -β-arrestin-MAPK. Recent studies have found that, PI3K-dependent Akt phosphorylation is an early event in UC inflammatory signals, and transient activation of Akt accompanied by JNK MAPK activation. So we hypothesized that chemokines-chemokine receptor-β-arrestin-PI3K/Akt-JNK MAPK signaling pathway plays an important role in the change of the PC system in UC mouse. This study intends to explore the effect of chemokine receptor CXCR4 in UC by gene knockout mouse, and further isolate and identify microvascular endothelial cells of mouse colon tissue to analyze molecular mechanism of CXCR4 in the change of PC system in UC mouse by flow cytometry, immunoprecipitation and other technic, so as to provide a theoretical as well as experimental basis for the treatment of UC.

微血管内皮细胞是参与溃疡性结肠炎（UC）最重要的非免疫细胞，而蛋白C（PC）系统是血管内皮功能重要的介导者，在调节肠稳态方面发挥重要作用。本课题组前期研究发现，PC系统在硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的UC小鼠被抑制，其机制涉及浆细胞-免疫复合物-巨噬细胞-趋化因子-β-arrestin-MAPK这一通路。研究发现，PI3K依赖的Akt磷酸化是UC炎症信号的早期事件，且Akt瞬时激活伴有JNK MAPK激活，因此我们推测趋化因子-趋化因子受体-β-arrestin-PI3K/Akt-JNK MAPK信号通路在UC小鼠PC系统改变中起重要作用。本项目拟通过基因敲除小鼠，探索趋化因子受体CXCR4在UC病理过程中的作用，并进一步分离鉴定小鼠结肠组织微血管内皮细胞，通过流式细胞术、免疫共沉淀等技术分析CXCR4在UC小鼠PC系统改变中的信号通路机制，为UC的治疗提供理论依据和实验基础。

趋化因子参与调节UC时PCS的变化，但其通过何种途径引起PCS改变并不清楚。本研究应用野生及Cxcr4-/-小鼠复制UC模型，发现Cxcr4-/-小鼠造模后，与野生小鼠造模相比，炎症程度明显降低，PCS活性有所升高；通过分离培养小鼠结肠黏膜MVECs，发现CXCR4过表达进一步加重SDF-1α对MVECs的PCS的抑制，初步证实CXCR4参与UC时PCS的抑制。检测假设的信号通路相关蛋白表达，发现Cxcr4-/-造模小鼠β-arrestin、PI3K/Akt、JNK、pJNK、c-Jun表达水平较野生造模小鼠均明显降低，证明该信号通路参与调节UC时PCS的变化。应用JNK MAPK抑制剂SP600125，发现SP600125预处理的DSS小鼠结肠PI3K/Akt水平明显抑制，但CXCR4、β-arrestin无改变；体外用SDF-1α刺激MVECs模拟炎症状态，也得到了相同的结果；应用PI3K抑制剂LY294002，发现LY294002在体内外均不改变CXCR4、β-arrestin、pJNK表达水平，提示JNK MAPK可能位于CXCR4、β-arrestin下游，PI3K/Akt上游。利用构建的过表达或沉默相关基因的MVECs，发现沉默CXCR4导致β-arrestin抑制，沉默β-arrestin导致pJNK 抑制，沉默JNK导致PI3K和c-Jun表达降低，但PI3K/Akt过表达或沉默均不影响c-Jun表达，证实JNK MAPK是连接β-arrestin和PI3K/Akt的中介。再利用免疫共沉淀实验探究各蛋白的相互作用，发现CXCR4和β-arrestin相互作用，JNK MAPK和β-arrestin相互作用，PI3K和JNK MAPK相互作用。最后，构建各种质粒研究互作蛋白的作用位点。根据GST-Pull down实验结果，CXCR4-C与β-arrestin1相互作用，JNK3-N和β-arrestin1相互作用。.综上，本课题通过动物和细胞实验，重点探讨PCS调控信号通路作用，这些结果不仅为UC 发病机制提供理论依据，也为UC 相关药物研发开辟新途径。项目资助发表SCI论文5篇，核心论文5篇，其他英文论文1篇。联合培养硕士生1名，已毕业。项目投入经费18.0000万元，支出17.9974万元，剩余经费0.0026万元，计划用于本项目后续研究支出。