毒力因子CFP10在结核杆菌感染巨噬细胞过程中与宿主因子相互作用的机理研究

结核病是由结核杆菌感染引起的、造成我国公民死亡最多的人兽共患传染病之一。已有的研究证实结核杆菌毒力因子ESAT6和CFP10在结核杆菌感染宿主致病过程中起重要作用。在前期研究中，我们初步验证CFP10蛋白可与巨噬细胞的亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1（SAT1)相互作用。资料显示SAT1可清除细胞内的多胺而诱导细胞凋亡；结核杆菌毒力株感染可抑制巨噬细胞凋亡。结核杆菌能否通过其毒力因子影响SAT1活性来调控巨噬细胞凋亡尚不清楚。本研究将采用SPR技术分析确定CFP10蛋白与SAT1发生相互作用的具体结构域，并构建CFP10蛋白的真核表达载体，转化巨噬细胞U937，检测CFP10对SAT1的活性以及巨噬细胞凋亡的影响。分析CFP10与SAT1的相互作用在结核杆菌感染过程中的功能，为进一步揭示结核杆菌胞内寄生的分子机理提供科学依据。

课题组开展了以下工作：.1．将结核杆菌CFP10基因及其各结构域对应DNA片段克隆并亚克隆至PGEX4T-1原核表达载体中，另外还将CFP10基因亚克隆至PET32a原核表达载体中，并完成了表达和western-blot检测，及两种载体荷有的CFP10基因原核表达蛋白纯化工作。将牛SAT1基因克隆，亚克隆至PET32a原核表达载体中，获得蛋白原核表达，并获得纯化产物；利用pull-down技术寻找CFP10蛋白与SAT1蛋白相互作用的最佳实验条件，目前，尚未找到这两个蛋白相互作用的实验条件，阻碍了用SPR（surface Plasmon resonance）方法进行后续寻找相互作用结构域的实验。.2．将CFP10基因最终亚克隆至真核表达载体pEGFP-N1中，获得pEGFP-N1-CFP10载体。用重组载体转染真核细胞U937，获得外源基因表达，但是转化效率低。针对转化效率低的困难，项目组成员用pEGFP-N1-CFP10载体转染了293T细胞，获得CFP10基因表达。利用激光共聚焦显微技术观察到转染后细胞中EGFP-CFP10融合蛋白主要分布于两种真核细胞的细胞质中。.3．流式细胞技术对转染后细胞的凋亡率检测，初步发现CFP10蛋白，可促进转染细胞的凋亡。.4．对5个凋亡相关基因在转染前、后细胞中的表达变化进行实时定量PCR技术检测，发现转染后细胞中Caspase 8基因的相对表达量在12 h、24 h、48 h时有显著上调，Bcl-2基因在48 h时相对表达量有显著下调，Caspase 3基因的相对表达量在48 h时相对表达量有显著上调，Bax、AIF基因在12 h、24 h、48 h时相对表达量变化不显著，提示CFP10蛋白在宿主细胞内并不能抑制细胞的凋亡。