CpSIZ1介导的SUMO化修饰对蜡梅花发育和抗寒性调控途径的探索

项目拟在前期从蜡梅中获得SUMO化修饰的关键基因CpSIZ1和若干可能的靶基因的基础上，首先在离体条件下通过免疫共沉淀试验筛选获得CpSIZ1介导的SUMO化修饰调控的底物种类，从而判断CpSIZ1介导的SUMO化修饰调控的可能途径；然后检测CpSIZ1基因及其它已克隆的蜡梅花发育与抗寒相关基因在蜡梅上转录水平的变化，对信号通道进行印证分析；最后通过异位表达的方法寻找到CpSIZ1基因对蜡梅花发育和抗寒性影响的表型证据，针对表型变化，根据项目试验结果并结合其它相关研究，进一步分析明确CpSIZ1介导的SUMO化修饰对蜡梅花发育和抗寒性调控的可能途径。项目的完成将加深我们对植物SIZ1基因功能和蜡梅特殊开花抗寒机理的认识，丰富植物开花、抗寒理论，为木本植物开花调控和抗寒研究提供新的切入点，可望为生产上开发农林作物花期霜冻防御及蜡梅花期调控技术提供一些理论参考。

本研究通过简并PCR结合RACE技术，从蜡梅花中克隆得到了一个SUMO化E3连接酶基因CpSIZ1,该基因的编码蛋白具有E3连接酶活性位点MIZ/SP-RING锌指保守结构域，与已知的其他物种中的SIZ1基因具有一定的同源性，同时也具有明显的种属特性。生物信息学分析表明CpSIZ1基因的编码蛋白是一个无信号肽和跨膜结构，非分泌型的不稳定亲水性蛋白，该蛋白发挥作用的主要场所可能存在于线粒体、微体等细胞器的基质中。在离体条件下通过免疫共沉淀等试验初步证明HSP、STY可能为受CpSIZ1介导的SUMO化修饰调控的蛋白之一。利用实时荧光定量PCR技术检测蜡梅CpSIZ1基因和蜡梅发育、抗逆相关基因CpHSP、CpLTP、CpCOR413、CpAP3、CpFLD、CpSTY和CpMYB1共8个基因在蜡梅不同组织、花器官的不同部位、蜡梅花发育的不同时期和低温（4 ℃）胁迫下幼苗嫩叶中的表达情况，结果表明蜡梅CpSIZ1基因在蜡梅各个组织中均有表达，在花发育早期的萌动阶段未检测到该基因的表达，但随着花器官的不断发育，表达量逐渐升高，前期筛选的与蜡梅发育、抗逆相关的其他7个基因则表现出不同的表达模式。说明蜡梅SUMO化E3连接酶CpSIZ1基因及蜡梅发育、抗逆相关基因的表达具有一定关联性，但特征规律不明显。. 通过在AtSIZ1基因敲除的拟南芥siz1-3突变体中超表达蜡梅CpSIZ1基因的回复实验验证蜡梅CpSIZ1基因的功能，结果显示超表达蜡梅CpSIZ1基因的转基因拟南芥siz1-3突变体的表型得以恢复。进一步在自然生长条件和低温胁迫处理后检测三种拟南芥株系中目的基因SIZ1及其可能作用的靶基因的表达，结果显示蜡梅发育及抗性形成相关功能基因表现出不同的表达模式，表明CpSIZ1可能在多个途径上，通过对介导目的蛋白的SUMO化发挥其调控功能，影响蜡梅花发育和抗寒性。项目结果加深了我们对植物SIZ1基因功能和蜡梅特殊开花抗寒机理的认识，为进一步进行蜡梅开花调控和抗寒研究提供了新的切入点。