亚硝酸盐抑制红肉血红素蛋白氧化催化机制研究

Owing to the existence of hemoprotein ferroporphyrin in red meat and its products, which can easily combine with various ligand binding and react catalytic oxidation, it may derive high active cytotoxic substances. While the usage of carcinogenic nitrite into meat-products can inhibit the catalytic oxidation of hemoprotein in muscle, whereas research today lacks cognitive mechanism in the key reaction of these molecules. This project uses the gel electrophoresis, spectral structure analysis, proteomics, bioinformatics and other means to establish the models of hemoprotein-H2O2 oxidation system and NaNO2 inhibition of hemoprotein catalyzed lipid oxidation, which is related to red meat hemoprotein oxidation with-H2O2, NaNO2 inhibition hemoprotein-H2O2, and the cross-linking between NaNO2 and Tyrosine-heme. It helps to analyze heme changes and oxidation mechanism in hemoprotein oxidation and to investigate the inhibitory effects of NaNO2 on hemoprotein, such as the direct inhibition of hemoprotein by NaNO2, and the role of NaNO2 in combination with the two pathways of hemoprotein binding, to reveal the mechanism by which NaNO2 inhibits the catalytic oxidation of hemoprotein to lipid oxidation and the new metabolic pathway. The above contents have theoretical significance and practical value for the generation and development of the potential toxic substances and the improvement of the safety of red meat.

红肉及制品中由于血红素蛋白卟啉铁的存在，易与多种配体结合发生氧化催化作用，进而衍生出高活性细胞毒性物质，而具有致癌风险的亚硝酸盐应用于肉品中，可抑制肌肉血红素蛋白氧化催化，但是对这些分子物质的关键反应缺乏机制认知。本项目采用凝胶电泳、光谱结构解析、蛋白质组学、生物信息学等手段，建立红肉血红素蛋白-H2O2、NaNO2抑制血红素蛋白-H2O2、NaNO2与酪氨酸-血红素交联物作用下血红素蛋白-H2O2氧化体系及NaNO2抑制血红素蛋白催化脂质氧化模型，解析血红素蛋白氧化过程中血红素变化规律及氧化机制，探索NaNO2抑制血红素蛋白等决定性反应，NaNO2直接抑制血红素蛋白氧化及NaNO2结合酪氨酸-血红素交联物抑制血红素蛋白氧化这两种途径的作用，揭示NaNO2抑制血红素蛋白催化脂质氧化进而影响蛋白质氧化机制以及新代谢途径。对于认知潜在毒性物质的形成和消长，提高红肉安全性具有理论意义和实际价值。

本项目以牛肉（红肉）背最长肌为主要研究对象，以鸡肉（白肉）为对照。由于牦牛肉中肌红蛋白含量比肉牛高，部分试验用牦牛肉结果更显著、更具代表性，同时用羊肉来增加研究的广泛性，并且为了指导亚硝酸钠的实际生产应用，本项目也对咸牛肉和咸鸭肉中亚硝酸钠的添加效果进行了研究。采用拉曼光谱、透射电镜、傅立叶红外光谱、GC-MS以及LC-MS/MS等技术，探究了血红素变化规律、NaNO2抑制血红素变化的规律、NaNO2抑制脂质氧化与蛋白氧化互作的规律。主要研究结果如下：1. 氧化导致牛肉和鸡肉肌红蛋白卟啉环扩张，α-螺旋和β-折叠含量下降。2. NaNO2可以抑制牛肉和鸡肉肌红蛋白卟啉环的扩张和α-螺旋、β-转角的下降，维持肌红蛋白结构稳定。3. NaNO2可直接作用于Mb形成NOMb，NOMb较为稳定，不容易发生氧化还原反应；血红素从血红素蛋白中释放出来后与游离酪氨酸形成交联物，进一步与NaNO2结合，增强血红素过氧化物酶活性，从而抑制血红素蛋白氧化。4. NaNO2提高肌肉内源抗氧化酶活力，降低活性氧（ROS）水平，阻碍了ROS对血红素蛋白的氧化。5. NaNO2的添加导致肌肉中NOMb的形成，抑制了肌红蛋白自氧化，减少了原卟啉IX的降解和血红素铁的释放，导致肌肉脂质氧化减慢。6. 在肌红蛋白和线粒体还原及NOS催化作用下，NaNO2转化为NO，提高电子呼吸链复合物活力，促进了高铁血红素蛋白还原。7. NaNO2腌制可以提高羊肉和鸡肉的食用品质，抑制脂质氧化，且当羊肉NaNO2的添加量为100 mg/kg，鸡肉NaNO2的添加量为150 mg/kg时抑制作用较强。8. 100 mg/kg NaNO2能提高咸牛肉的品质、抑制蛋白氧化，150 mg/kg NaNO2抑制咸鸭肉蛋白氧化。综上所述，本项目从肌红蛋白氧化还原、结构稳定、亚硝基化角度，阐明了NaNO2直接和间接抑制血红素蛋白氧化的作用机理，并确定了红肉加工过程中添加100 mg/kg NaNO2有利于抑制血红素蛋白氧化催化和品质调控，白肉中NaNO2的添加量为150 mg/kg，为肉类加工正确应用和控制亚硝酸盐提供理论依据。