上转换荧光纳米颗粒的表面可控精准修饰及其生化分析应用研究

Recently, upconversion fluorescent nanoparticles (UCNPs) have attracted increasing attention due to their excellent performance acting as probes for the detection of critical biomarkers; however, owing to the lack of in-depth understanding of the UCNPs’ surface properties, it remains challenging in the site-specific and quantity-controllable modification of functional biomolecules on single UCNPs. To solve this issue, in this project we propose to reveal the binding mechanism between the UCNPs’ crystal structure and the ligand molecules via systematically investigating their varied binding strength on the different facets of UCNPs. Based on this, we plan to functionalize the facets of UCNPs that are appointed to be exposed with the selected ligands, achieving the site-specific and quantity-controllable surface modification. Taking advantage of the innovative surface functionalization technique, on one hand, we propose to set up digital bioassay systems for the high-throughput single molecule sensing that utilize the lifetime values and the surface plasmon resonance enhanced fluorescence properties of UCNPs as encoders; on the other hand, we will establish a chiral self-assembly system that is triggered by the nucleic acid molecules, which can be employed in high-sensitivity sensing of nucleic acid pathogenic markers according to the intensity of the circularly polarized fluorescence of the UCNPs self-assembly structure.

近年来，上转换荧光纳米颗粒作为性能优异的生物标记探针受到了广泛关注；然而，当前学术界对其表面性质仍缺乏深刻理解，特别是在其表面进行位点、数目精准可控的功能生物分子修饰仍存在很大挑战。针对这一关键问题，本项目创新性提出通过系统研究上转换纳米颗粒的不同晶面对亲合基团的选择性结合能力，深入揭示其晶体结构与表面配体分子的作用机理，进而利用选择性晶面暴露策略，优选合适的功能化亲合配体，实现功能生物分子在上转换纳米颗粒表面的位点及数目精准可控修饰。以此为基础，一方面，分别创新性构建时间分辨和表面等离子共振荧光增强数字化芯片检测系统，以上转换纳米颗粒的荧光寿命和对偏振激发光的响应为编码，实现重要生物分子的高通量、数字式单分子分析；另一方面，创新设计由核酸分子引发的手性自组装结构，通过监测其手性荧光信号的强度实现对病原标志物核酸分子的高灵敏度检测。

在项目执行期内，使用生物活性分子对包括上转换荧光纳米颗粒在内的多种纳米材料进行了精准功能化修饰，并构建了一系列用于检测疾病相关标志物分子的技术平台。（1）基于纳米颗粒计数的生物标志物分子检测：分别使用抗体和核酸分子对金纳米颗粒进行表面功能化修饰，通过免疫偶联或核酸扩增，控制可被磁分离的纳米颗粒数量，使反应体系中纳米颗粒数目与目标分子浓度具有相关性，建立了基于纳米颗粒计数策略的前列腺癌抗原和microRNA的检测方案；（2）数字式纳米颗粒计数生物标志物分子检测技术：在磁性纳米颗粒表面修饰核酸分子，作为DNA纳米机器人的行走轨道或碱性磷酸酶的底物。通过合理控制靶标分子和微球之间的浓度关系，可以使DNA纳米机器人和碱性磷酸酶的反应限制在单个纳米颗粒表面。通过靶标分子引发的信号转导，将荧光信号富集到磁性纳米颗粒表面，此时负载有荧光信号的纳米颗粒数量与靶标分子数目一致。使用全内反射显微镜对负载有荧光信号的纳米颗粒进行计数，即可实现数字式microRNA和碱性磷酸酶检测；（3）单微球拉曼扫描分析技术：使用核酸分子和抗体共同在金纳米颗粒表面进行稳定修饰，用于在单个微球表面构建等离子层。通过抗原对抗体或miRNA-DNA双链分子的特异性偶联，捕获另一层负载有拉曼信号分子的金纳米颗粒，将靶标相关拉曼信号引入到微球表面，并通过双层金纳米颗粒对信号进行放大。使用拉曼显微镜对单个微球表面进行扫描，即可获取目标蛋白/核酸的定量信息。由于拉曼分子的独特的指纹图谱信息，采用该策略实现了对多种目标物分子的同时测定；（4）稀土纳米颗粒表面性能和相关生物标志物分检测应用研究：使用磷酸化多肽对二氧化铈纳米颗粒的活性表面进行了可控修饰，进而通过调控二氧化铈纳米颗粒的活性表面实现了对蛋白激酶的荧光、比色双重检测。本项目系统研究了纳米颗粒表面功能化修饰方法，并发展了一系列基于表面功能化纳米颗粒的生物标志物分子检测体系，为面向临床诊断的生物标志物检测提供了新的思路。