利用RNA-Seq分离鉴定西葫芦ZYMV病毒抗性相关基因

小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）是西葫芦（Cucurbita pepo L.）等葫芦科作物生产中的重要病害之一。本项目拟利用转录组测序技术（RNA-Seq），对ZYMV侵染诱导后西葫芦抗病植株的全基因组表达谱进行分析，以系统筛选与ZYMV抗性相关的差异表达基因，同时对基因进行功能注释、功能分类及所属信号通路分析等，以揭示植物防御抗病过程涉及的分子通路以及关联表达基因。并在此基础上，对潜在的关键基因进行RNAi及过表达分析，初步鉴定其抗病功能。该研究能够在全基因组水平上完整展示病毒侵染后植物的基因表达变化，对阐明植物的抗病应答分子机制，以及拓展潜在抗病基因在西葫芦等葫芦科作物抗病分子育种中的应用具有重要价值。大量ESTs序列的获得将改变南瓜属作物ESTs资源匮乏的现状，为葫芦科作物比较转录组学研究及同源基因克隆奠定坚实基础。

课题严格按照计划执行，完成了研究任务并达成目标，主要获得以下结果：（1）首先建立了西葫芦苗期ZYMV病毒病抗性评价体系，筛选到用于转录组测序挖掘抗病相关基因的高抗与高感病毒病西葫芦自交系材料。并揭示其抗性由一对显性抗病基因控制。（2）转录组测序设置4个处理（ZYMV接种的高抗、高感材料，缓冲液接种的植株为各自对照），每处理10株混合取接种后24小时的真叶进行测序，分别获得了3G以上的高质量测序数据；西葫芦转录组GC含量47%左右，Unigene 73148条，平均长度582.6 bp，长Unigene（≥1K）11108条。并对Unigene进行了编码区预测、蛋白序列分析、功能注释以及表达丰度分析；获得两份材料间可靠SNP位点2287个，SSR位点4129个。（3）抗、感材料间ZYMV病毒诱导的差异表达基因有402个（表达量差异1倍以上）；抗病材料在病毒诱导与对照处理间差异表达基因有104个。经对差异表达基因的聚类分析、功能注释、处理间表达量比较等分析后获得候选ZYMV抗病相关基因33个，主要为病程相关基因、细胞壁形成因子、ATPase亚基编码基因以及生长素相关基因等。（4）利用qPCR对其中15个基因的表达谱进行分析验证，证明了转录组测序结果的可靠性，并进一步明确了这些基因在病毒诱导不同时间的表达特点。利用RACE技术克隆了2个基因（CpGp1与CpPr1）的全长序列，并构建了两个基因的RNAi及植物过表达载体。（5）成功将两个基因的RNAi载体转化抗病材料CpZR1，获得了3个转基因植株，但没能将过表达载体成功转化感病材料；经Northern杂交及qPCR分析，基因CpGp1在其RNAi转化植株中经病毒诱导后表达受到抑制，植株接种病毒后抗病能力减弱，证明其在ZYMV的抗性中可能具有关键作用；而基因CpPr1的表达谱在其RNAi转化植株与对照间没有明显变化，植株接种病毒后也和对照植株没有明显区别，可能抑制效果较差导致此结果。（6）在筛查开发EST-SSR基础上，对西葫芦两个ZYMV抗病基因（ZYMV1、ZYMV2）及一个白粉病抗病基因（Pm1）进行了遗传定位，分别获得了与其紧密连锁的分子标记，遗传距离0.4-3.3 cM。并将这些标记应用于西葫芦抗病回交育种中，节约了育种成本，提高了效率与新品种培育速度。（7）发表文章4篇，申请国家发明专利3项，毕业硕士生2名。