利用RNA-seq鉴定枸橼抗柑橘溃疡病相关基因的研究

柑橘溃疡病是严重危害世界柑橘产业发展的检疫性病害。由于缺乏高抗的种质，柑橘抗溃疡病育种始终没有取得实质进展。本课题组近年从收集的柑橘属植物中筛选出抗柑橘溃疡病的枸橼为抗病育种奠定了基础，为了探明抗病机理，本研究拟利用高通量的转录组测序（RNA-Seq）技术获得枸橼应答溃疡病菌入侵时非亲和互作过程的基因转录谱；然后通过EST功能分类明确3～5个抗病反应过程中的重点靶标基因，采用RACE法获取其全长cDNA序列；通过Real-time PCR技术研究靶标基因表达的时空规律，以求更准确、全面地认知枸橼-溃疡病菌非亲和性互作的分子机制，研究结果有利于植物抗病分子机制理论的深入研究，对柑橘溃疡病抗病育种取得突破具有重要意义。

柑橘溃疡病是限制柑橘产业发展的主要检疫性病害，到目前为止，生产上还没有能防治溃疡病的有效途经，抗病品种的应用是唯一解决这一病害的途径。经过多年的抗病资源筛选，本实验室从柑橘属资源中找到一个独特的抗溃疡病种质（C05-1）并命名为抗病枸橼。本研究通过对抗病种质枸橼和感病种质冰糖橙接种柑橘溃疡病菌后的连续病情观测和取样，运用Illumina RNA-seq高通量测序对样品进行了转录组测序，同时运用生物信息学手段和方法分析了枸橼在接种溃疡病菌前后基因的差异表达及功能注释。本研究主要结果如下：1.按照枸橼在接种柑橘溃疡病菌前后病情发展的时序性将试验分为三个阶段，即接种病菌前（RC1）、初始发病期（RC2）和病情抑制期（RC3），进行采样、测序及后续验证。2.高通量测序每个样本获得转录组的约13000000条短读序(1.2 Gb)，用生物信息学方法每样本从头组装并注释了约18000个Unigene(单基因簇)。其中，RC1-VS-RC2阶段特异表达基因为1409个, RC2-VS-RC3阶段特异表达基因有2554个。通过基因差异分析，上调基因分别为939和690个基因，下调基因为别为470和1864个基因。3.通过基因功能注释分析结果显示，注释到GO (gene ontology)的基因共有15951个，注释到KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)的基因共有18607个，其中这些基因主要为参与植物-病原菌互作、编码与黄酮类化合物合成相关的各种酶类、结合功能、转录调控、代谢等功能注释的基因。 4. 在KEGG的显著性富集分析中，发现RC1-VS-RC2阶段和RC2-VS-RC3阶段分别有856、1545个差异表达基因参与到pathway代谢途径，其中分别有211个、342个差异表达基因与植物-病原菌互作代谢途径（plant-pathogen interaction）有关。 5.通过荧光定量PCR成功验证了14个基因的相对表达量与RNA-Seq结果一致，证明测序相对准确可靠，为柑橘抗溃疡病育种研究提供了数据支持。.通过对项目研究，课题组在Sci期刊和国内核心期刊发表论文2篇；参加国际学术交流4次，大会报告2个；培养研究生2名。顺利完成研究任务，达到预期研究目标。研究结果达到国际先进水平。