流感病毒核输出蛋白的结构和作用机制研究

Influenza is an acute, highly contagious disease caused by influenza viruses and often results in epidemics or pandemics among humans and animals. Influenza pandemics and annual seasonal flu have posed serious threats on human health and led to tremendous economic losses. Nuclear export protein (NEP) plays a crucial role in nuclear export of viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs), which makes it an ideal target for development of anti-influenza drugs. In this study, we will use insect cell expression system to express different influenza virus NEP proteins with low similarity in their primary sequences, and the structure of NEP will be further stabilized by co-crystalizing with monoclonal antibodies or proteins interacting with NEP in nuclear export complexes. X-ray crystallography will be used to solve the structures of full-length NEPs, as well as NEP-mediated nuclear export complexes. We will combine structural studies and functional experiments at the protein, cellular, and viral levels to elucidate the molecular mechanism of NEP-mediated nuclear export of vRNPs, and identify key amino acids on NEP affecting the assembly of nuclear export complexes. We will also screen out NEP-specific monoclonal antibodies that affect the assembly of nuclear export complexes and elucidate the molecular mechanism by analyzing the crystal structures of antibody-NEP complexes. Our study will provide structural basis for the design of anti-influenza drugs targeting NEP.

流感是由流感病毒引起的、流行于人群和多种动物中的急性、高度传染性疾病。四次大流感的暴发和每年季节性流感的传播严重威胁着人类健康并造成重大经济损失。流感病毒的核输出蛋白（NEP）在病毒核糖核蛋白复合体（vRNP）的细胞核输出过程中起关键作用，也是抗流感药物研发的重要靶点。本研究拟采用昆虫细胞表达系统来表达一级序列相差较大的多种流感病毒NEP蛋白，并利用单克隆抗体和出核复合物中与NEP有相互作用的蛋白，进一步稳定NEP的结构，利用X-射线晶体学方法获得NEP的全长结构以及NEP介导的出核复合物的结构，结合蛋白、细胞和病毒水平的功能实验，阐明NEP介导流感病毒vRNP出核的分子机制，发现影响其相互作用的关键氨基酸，筛选出能影响出核复合物组装的NEP单抗并解析其结构，为针对NEP的抗流感药物设计提供结构学依据。

流感是由流感病毒引起的、流行于人群和多种动物中的急性、高度传染性疾病。四次大流感的暴发和每年季节性流感的传播严重威胁着人类健康并造成重大经济损失。流感病毒的核输出蛋白（NEP）在病毒核糖核蛋白复合体（vRNP）的细胞核输出过程中起关键作用，也是抗流感药物研发的重要靶点。. 本项目使用昆虫细胞表达系统，完成了8种不同亚型和不同型的NEP蛋白的表达、纯化和结晶条件筛选，最终未能筛选到可以收集数据的晶体生长条件。说明NEP蛋白自身柔性太大，单独不能有效结晶。此外，我们利用昆虫细胞成功表达了H3N2亚型流感病毒的NEP-聚合酶复合物，并证明二者在体外能够结合，目前仍在进行冷冻电镜结构条件的优化，这将大大提高获得NEP结构的可能性。我们利用昆虫细胞成功表达了NEP-出核复合物，但二者在体外不能结合，下一步计划对CRM1进行去除其他结合蛋白的处理后，再与NEP共孵育，并进行冷冻电镜结构解析。我们的研究为NEP蛋白的结构研究提供了宝贵的经验并指明了方向。. 另一方面，我们还发现H5N6病毒HA蛋白131位氨基酸缺失，在129位产生一个新的N-连接糖基化位点，降低了膜融合的pH阈值，增加了HA的酸和热稳定性，从而促进了H5N6病毒在哺乳动物宿主中的适应性，HA结构解析揭示了H5N6禽流感病毒获得哺乳动物适应性的分子机制。我们还研究了一株流感病毒广谱人源单克隆抗体PN-SIA28对多种亚型流感病毒的结合谱和中和谱，以及对小鼠的抗流感保护作用，并通过结构研究揭示了PN-SIA28能够广谱结合不同HA的独特的结合机制，为设计更有效的工程抗体、抗病毒药物或通用流感疫苗提供了有益的结构信息。