流感病毒核输出蛋白NEP调控病毒vRNA、cRNA和mRNA合成的分子机制研究

The influenza virus nuclear export protein NEP can regulate the synthesis of viral vRNA, cRNA and mRNA and such regulation is independent on its nuclear export function. What’s more, the molecular mechanism of the regulation is unclear. Using human, pig, and avian influenza virus as subject, this study intends to clarify the inter-relationship between the level of polymerase activity and the regulation of NEP. With the two different NEPs with distinctive effects upon the regulation of polymerase activity, we also aim to discover the key function sites on NEP in regulation. What’s next are four aspects: 1. we will study the interaction between NEP and the polymerase proteins by employing the BiFC and Co-IP to make clear the function of NEP on the formation of polymerase complex; 2. by determining the effect of NEP on the binding between polymerase complex and vRNA or cRNA, the relationship between the NEP regulation and the viral polymerase replication initiation is to be revealed; 3. by determining the effect of the mutation of key sites on NEP and replication initiation domain on svRNA level, we will reveal its role in NEP regulation; 4. by clarifying the effect of different PA on svRNA-PA interaction, the role of PA and svRNA in the regulation on viral RNA synthesis by NEP is to be revealed. This project sets its ultimate aim at making a clear elucidation of the molecular mechanisms of the regulation of NEP on RNA synthesis of influenza A virus.

流感病毒核输出蛋白NEP可以调控病毒vRNA、cRNA和mRNA合成，这种调控不依赖于其核输出功能，其具体调控机制未知。本项目以人、猪、禽流感病毒为研究对象，首先阐明病毒聚合酶活性高低与NEP调控作用之间的关系；并从对聚合酶活性增强效果差异巨大的两个NEP出发，寻找NEP发挥调控功能的关键位点。然后，从四个方面研究：1.利用BiFC及Co-IP研究NEP同聚合酶蛋白的互作，阐明NEP在聚合酶复合物形成中的作用；2.明确NEP对聚合酶复合物结合vRNA和cRNA模板的影响，阐明其调控作用是否通过改变聚合酶复制起始来实现；3.明确NEP关键位点及复制启动子区的突变对svRNA产生的影响及其在NEP调控中的作用；4.阐明不同聚合酶蛋白PA对svRNA-PA互作的影响及其在NEP调控中的作用，揭示NEP通过svRNA及PA调控病毒RNA合成的机制。最终解析NEP调控流感病毒RNA合成的分子机制。

流感病毒核输出蛋白NEP可以调控病毒vRNA、cRNA和mRNA合成，这种调控不依赖于其核输出功能，其具体调控机制未知。本项目拟揭示出流感病毒聚合酶自身活性的高低与NEP对其调控作用间的内在联系；确定影响流感病毒转录和复制的NEP关键功能位点；揭示NEP调控流感病毒vRNA，cRNA和mRNA合成的分子机制。通过项目的实施，已完成了项目设定的研究目标。研究发现流感病毒NEP 蛋白可以调控病毒的转录和复制，影响病毒vRNA，cRNA和mRNA的合成，且该调控不依赖于病毒的NP蛋白。揭示出聚合酶自身活性的高低与NEP对其调控作用间的内在联系，即NEP对病毒聚合酶活性的调控依赖于聚合酶活性的初始水平，当聚合酶活性高时，NEP抑制聚合酶活性，当聚合酶活性低时，NEP促进聚合酶活性。进一步确定了影响流感病毒转录和复制的NEP关键功能位点，并在病毒复制水平进行了验证。我们发现，NEP对聚合酶活性的调控不依赖于流感病毒的小病毒RNA(svRNA)，但NEP能影响聚合酶蛋白及核蛋白间的相互作用，NEP对聚合酶的调控作用同流感病毒聚合酶复制启动子区有关，NEP能促进聚合酶复合物结合vRNA模板的量。本项目阐明了NEP 对流感病毒转录和复制的调控机制，对于我们更深入地理解流感病毒的生命周期具有重要意义，也将为抗流感病毒药物的研发提供新的思路。本项目发表论文9篇，其中SCI收录论文8篇，培养研究生5名。