利用光遗传学技术研究脑缺血后神经血管单元调控机制及内皮细胞分泌的bFGF在促进功能恢复中的作用和机制

Our previous work, supported by the National Natural Science Foundation of China, had revealed that intrinsic neuronal activities regulate neurogenesis and angiogenesis after ischemic injury through multiple mechanisms. Regulation of striatal neuronal activity affects the survival and migration of neural stem cells (JCBFM 2017), induce the secretion of growth factors such as bFGF by endothelial cells and subsequently promote angiogenesis, inhibit cell death, and improve neurological function (Stroke 2017). Based on these previous work, this project proposes to 1) Use optogenetic techniques to investigate the function and mechanism of action of endothelial secreted bFGF, induced by the inhibition of GABAergic neuronal activities, in post-stroke recovery; 2) Investigate the efficacy and mechanism of bFGF gene therapy in ischemic stroke model of mice; 3) Using in vitro neuron-astrocyte-endothelial cell co-culture model, investigate the ability of bFGF gene modified endothelial cells (bFGF-EC) in protecting the tri-cell system against oxygen-glucose-deprivation insult. The results from this study will inform the development of novel strategies to treat ischemic stroke.

在自然科学基金支持下的前期工作中，我们发现脑缺血损伤后的内源神经元活动通过多种途径调控神经再生、血管新生和功能康复。调控内源纹状体神经元活动可以促进神经干细胞的迁移和存活（JCBFM 2017），可以促进内皮细胞分泌bFGF等生长因子，并促进血管新生、抑制细胞凋亡、改善神经功能（Stroke 2017）。在此基础上，本项目计划：1）利用光遗传学技术，研究GABA能神经元调控内皮细胞分泌的bFGF对脑缺血后康复中的作用机制，2）研究在小鼠脑缺血模型中，bFGF基因治疗对脑缺血后神经功能康复的作用和机制，3）研究在体外细胞模型中，bFGF基因修饰的内皮细胞对神经元-星形胶质细胞-内皮细胞共培养体系的保护作用和机制。项目研究结果将对发展卒中治疗新方法提供重要理论依据。

本项目以小鼠脑缺血为模型， 研究bFGF在促进功能恢复中的作用和机制。首先，利用Gad2-ArchT-GFP和Gad2-ChR2-tdTomato转基因鼠和光遗传学技术，我们证明了抑制纹状体GABA能神经元的活性上调bFGF基因的表达，而激活纹状体GABA能神经元 的活性则下调bFGF基因的表达。抑制纹状体GABA能神经元的活性可增加梗死边缘区血管的密度，而兴奋组梗死边缘区 的血管密度比相应的对照组比更低。抑制纹状体GABA能神经元的活性减少了梗死边缘区TUNEL阳性细胞的数量，提示抑制 纹状体GABA能神经元具有神经保护和促进血管新生的作用。体外细胞培养实验证明抑制GABA能神经元可以促进共培养的内皮细胞表达bGFG。我们进一步利用新型腺相关病毒AAV- PhP.eB为载体，研究了bFGF基因治疗对脑缺血后神经功能康复的作用和机制。利用这一载体，我们通 过静脉注射病毒来实现靶向脑内细胞的基因表达，克服了以往需要经脑立体定位注射实 现脑内基因表达的技术瓶颈。对正常小鼠中对病毒介导的mNG基因表达时间和在不同 类型的脑内细胞的表达时程和靶细胞类型的研究结果显示，在正常小鼠中，经尾静脉注 射携带目的基因的AAV-PHP.eB病毒可以有效实现在脑内包括神经元和胶质细胞中的目的 基因表达。令人意外的是，在向急性缺血性卒中模型造模一天后的小鼠尾静脉注射病毒 后，mNG基因的表达在两周内更集中于内皮细胞和胶质细胞，而较少在神经元中表达，这 一结果提示在缺血性卒中后，AAV-PHP.eB介导的基因表达的细胞类型特异性和表达时程 发生了变化。我们的基因治疗结果表明，通过AAV-PHP.eB介导的bFGF基因治疗，可以显著改善动物的运动功能，减少神经细胞凋亡，促进神经再生和血管新生，提示经静脉注射的AAV-PHP.eB-bFGF基因治疗有发展为卒中治疗新方法的潜力。在本基金和其它基金支持下，本项目累计发表标注基金支持的SCI论文14篇，详见基金项 目研究成果目录。