转录因子 Ascl1 在星形胶质细胞转分化为神经元的过程中的作用研究

Many neurological diseases are caused by neuronal loss. Direct reprogramming from fibroblasts and astrocytes into neurons are new progress in the field of stem cell and regeneration, which is different from that of the stem cell mediated differentiation pathway. Currently, the mechanisms underlying direct reprogramming remains largely unknown and the neuronal subtypes generated via direct reprogramming are still limited. The applicant’s previous works show that the transcription factor Ascl1 can convert astrocytes into neurons efficiently both in vitro and vivo. Meanwhile, serotonergic (5-HT) neurons in the central nervous system (CNS) are associated with many neurological diseases. The applicant’s preliminary results showed that several transcription factors (including Ascl1) can convert astrocytes into 5-HT neurons. This project will study how Ascl1 converts astrocytes into neurons and what roles Ascl1 plays during the conversion of astrocytes into 5-HT neurons, which ultimately will lay down the foundations for the treatment of diseases via cell transplantation and direct reprogramming in vivo.

神经系统疾病与神经元的死亡密切相关。从成纤维细胞及胶质细胞转分化得到功能性神经元细胞，是近年来干细胞与再生医学研究中的新进展，它提供了重编程-定向分化以外的另一种获得功能性神经元的方法。转分化研究目前面临着转分化机理还不明确、转分化产生的神经元种类还不完善等问题。申请人之前的工作表明，转录因子Ascl1可以高效地把星形胶质细胞转分化为神经元。另外，中枢神经系统中的5-羟色胺（5-HT）能神经元与许多神经系统疾病密切相关。申请人的前期预实验结果表明，一个新的转录因子组合（其中包括Ascl1）可以把星形胶质细胞转分化为5-羟色胺（5-HT）能神经元。本项目将探讨Ascl1 将星形胶质细胞转分化为神经元的作用机理及其在星形胶质细胞转分化为 5-羟色胺能神经元的过程中的作用。这些研究将加深人们对从星形胶质细胞转分化产生神经元及5-羟色胺能神经元的认识，最终为细胞移植及细胞原位转分化治疗奠定基础。

神经细胞直接重编程技术已经成为潜在的细胞替代治疗新手段。促神经生成基因 Ascl1 可把体外培养的星形胶质细胞转分化为神经元，同时 Ascl1 广泛应用于把非神经元细胞转分化为各种不同特定类型的神经元。目前 Ascl1 在细胞转分化中的作用还不清楚。本项目在体外培养的星形胶质细胞向神经元转分化的研究体系中，结合 RNA 测序（RNA sequencing, RNA-Seq）及染色质免疫共沉淀结合高通量测序技术（Chromatin Immunoprecipitation - sequencing, ChIP-Seq），分析了 Ascl1 可能通过调控哪些下游基因实现星形胶质细胞到神经元的转分化。RNA-Seq 结果显示，在星形胶质细胞转分化的第 2 天与第 5 天，有 1501个基因的表达发生显著改变。在星形胶质细胞转分化的第 2 天开展的 ChIP-Seq 实验结果显示，Ascl1 在 696 个基因的 955 个位点上有明显富集。这 696 个基因中，107 个基因的表达水平在转分化过程中有显著改变，它们可定义为 Ascl1 的直接下游基因。利用短发夹 RNA (short hairpin RNA，shRNA) 技术分析了Ascl1 的四个直接下游基因（Klf10、Myt1、Neurod4、Chd7）在 Ascl1 诱导的星形胶质细胞转分化为神经元过程中的作用。下调 Kfl10 基因的表达时，转分化得到的神经元的突起发生及动作电位的高度显著下降。下调 Myt1 及 Myt 家族基因 Mytl1 的表达，发现绝大多数转分化得到的神经元丧失了电生理活性。下调 Neurod4 及 Chd7 的表达，得到转分化神经元的效率显著降低。此外，过量表达 Neurod4 也可以实现一小部分星形胶质细胞转分化为神经元（6%）。这些工作为理解 Ascl1 诱导的星形胶质细胞-神经元转分化的分子机理提供了新的视角。