海洋芽孢杆菌（Bacillus marinus）B-9987中Macrolactins生物合成后修饰基因与调控基因的作用机制

Macrolactins是一类具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等活性的大环内酯类化合物，其骨架是由聚酮合酶（Polyketide，PKS）催化组装而成，骨架的修饰与生物活性密切相关，后修饰步骤的揭示不仅有助于阐明生物合成途径，而且能够为组合生物合成的研究提供新的切入点。本项目拟从比较基因组学入手，以源自我国渤海潮间带植物盐地碱蓬根内的海洋芽孢杆菌（Bacillus marinus）B-9987为研究对象，对Macrolactins生物合成后修饰基因和调控基因进行定位与功能鉴定，揭示后修饰步骤的分子机制和调控基因的正负调节功能，阐明Macrolactins的生物合成途径，为进一步通过组合生物合成和代谢工程手段理性扩展化合物结构多样性以及构建高产工程菌株提供直接的理论依据。

Macrolactins是一类具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性的24元大环内酯类化合物，具有良好的应用开发前景。Macrolactins的骨架是由聚酮合酶（Polyketide, PKS）催化组装而成，然而其生物合成基因簇只包含了结构基因和可能的抗性基因，参与其生物合成的后修饰基因以及调控基因一直未见报导。本项目以分离自我国渤海潮间带植物盐地碱蓬根内的海洋芽孢杆菌（Bacillus marinus）B-9987为研究对象，开展了macrolactins生物合成后修饰和调控相关基因的定位与功能研究。采用Mauve软件包对macrolactins产生菌（Bacillus marinus B-9987和Bacillus amyloliquefaciens FZB42），和非产生菌（Bacillus subtilis 168、Bacillus licheniformis和Bacillus pumilus）进行了比较基因组学分析，从中预测与定位了可能的糖基化后修饰基因和调控基因。经过系统的摸索，建立了B-9987的高效转化方法、表达系统和敲除系统。采用基因阻断和高表达手段对候选基因的功能进行了研究，结果揭示其中有2个基因（9987_0678和1410）参与了macrolactins的糖基化后修饰反应，4个基因（9987_0677，1390，3433和1684）以负调控的方式参与了macrolactins的生物合成。采用高表达或建议阻断策略构建了macrolactins高产工程菌株：通过关键酶反式酰基转移酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的高表达使macrolactins的产量提高了约0.6倍， 4个调控相关基因的阻断使macrolactins的产量提高了0.8-1.8倍，两个糖基转移酶基因的阻断使macrolactin A积累，产量提高了约5-7倍，这为macrolactins的研发提供了物质来源。进一步，对两个糖基转移酶进行了可溶性表达与体外酶学性质表征，结果表明二者能够接受不同的糖基供体和糖基受体，具有很强的底物广谱性，可作为工具酶用于macrolactins的结构多样性研究。本项目研究结果为通过组合生物合成和代谢工程手段理性扩展化合物多样性和积累目标化合物提供了可靠的科学理论和技术手段。