海洋链霉菌中P450酶参与催化吲哚咔唑化合物形成的新颖分子机制

The indolocarbazole compounds (ICZs) have been found to be potential multi-targeted anticancer clinical candidates through inhibitions against topoisomerases, protein kinases in cellular signal transduction pathways, as well as cell cycle regulatory factors. Streptomyces sanyensis FMA, isolated from a mangrove soil sample collected in Sanya, China, is capable to produce a series of ICZs, including Staurosporine bearing a cyclic N-glycosidic linkage between the 1’, 5’-carbons of the glycosyl moiety and the 12,13-nitrogens of the indolocarbazole ring, and Streptocarbazole possessing an exceptional cyclic N-glycosidic linkage between the 1’, 3’-carbons and the 12,13-nitrogens. In this project, on the one hand we are going to elucidate the pending enzymatic mechanism of C5’-N13 bond formation in Staurosporine catalyzed by P450 monooxygenase; on the other hand, we plan to uncover new P450 enzyme involved in C3’-N12 bond formation in Streptocarbazole. We will explore the molecular mechanism of the P450s-catalyzed C-N formation in depth, disclose their enzymatic properties and novelties, and demonstrate the regioselectivity of the two P450s. Our study will provide novel tool enzymes and reliable theoretical guidance for diversification of ICZs structures.

吲哚咔唑化合物（Indolocarbazoles，ICZs）能够通过拓扑异构酶、细胞信号转导通路中各种激酶以及细胞周期调控因子来实现多靶点抑制肿瘤生长，具有良好的临床开发前景。分离自我国三亚红树林的海洋链霉菌新种Streptomyces sanyensis FMA能产生分别含有1’, 5’-双苷化和1’, 3’-双苷化糖环的ICZs化合物星孢菌素（Staurosporine）和Streptocarbazole。本项目拟以链霉菌FMA为研究材料，（1）阐明P450催化星孢菌素中C5’-N12键形成的新颖生化反应机理，（2）从基因组中挖掘新的催化Streptocarbazole中C3’-N12键形成的新的P450，揭示酶催化反应的特性与新颖性，解析两个P450酶区域选择性地催化C-N键形成的新颖酶学分子机制，拓宽酶的底物特异性，为开展化合物结构多样性研究提供重要的工具酶和可靠的理论指导。

吲哚咔唑（Indolocarbazoles，ICZs）生物碱类化合物因其优良的抗肿瘤活性而备受关注。海洋链霉菌Streptomyces sanyensis FMA能产生分别含有1’, 5’-双苷化和1’, 3’-双苷化糖环的ICZs化合物星孢菌素（Staurosporine，STA）和Streptocarbazole。本项目以链霉菌FMA为研究材料，1、阐明了由P450 SpcN催化的星孢菌素中C5’-N12键形成的新颖分子催化机理：首次从体外验证了细胞色素P450酶能够催化C-N糖苷键的形成，并对SpcN的酶学性质进行了表征；解析了SpcN与底物holyrine A共结晶的蛋白质结构，结合定点突变鉴定出多个与底物结合和催化关键的氨基酸，提出了催化C-N键连接的分子机制。2、对吲哚咔唑环N-12位和糖环C’-3位之间C-N键的形成进行了探究：通过在异源宿主中表达spcI阻断的spc基因簇，获得了两个Streptocarbazole结构类似物；通过基因阻断确认spcN基因不参与N12-C3′糖苷键的连接，推测特殊糖苷键C5’-N12的连接可能为自发形成。3、ICZs结构类似物合成的设计与构建：STA对靶点的选择性与其糖环结构密切相关，通过在天蓝色链霉菌中重构STA的生物合成途径，获得了细胞毒活性和选择性良好的STA衍生物。另外，开展了海洋微生物中次级代谢产物生物合成基因簇的激活、活性化合物获取及其生物合成研究工作。本项目研究结果一方面加深了我们对ICZs生物合成的认识，为采用组合生物合成策略和化学酶法进行化合物结构多样性研究提供了可靠的科学理论指导；另一方面将为新药研发提供更多的先导化合物实体，促进形成具有我国自主知识产权的新药，具有重要的理论意义和应用价值。