蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）PTS系统及其在生物防治中的作用的研究

Bacillus cereus is a multifunctional microbe existed widely in the nature. In the medicine area, some Bacillus cereus strains are pathogenic bacteria that can secrete enterotoxin cause symptoms such as vomiting and diarrhea. While in the agricultural and environmental sciences, some Bacillus cereus strains belong to the probiotics that can promote the plant growth and plant disease resistance and also used for the environmental pollution controlling. Our group obtained an entophytic Bacillus cereus strain from the wheat root with good biocontrol effect on wheat sharp eyespot and constructed a transposon random insertional mutant library. From this mutant library, we screen out 10 mutant strains that have a reduced ability of biofilm formation. By inverse PCR and sequence comparison, we found a mutant strain that its EI coding gene sequence was inserted with a TnYLB-1 transposon and has a significant reduction in the ability of colonization. The phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system (PTS) is a highly conserved carbohydrate transport system in bacteria and the EI enzyme is a component of the phosphotransferase system. Based on the basis of the preliminary study, this project intends to study the structure, function and component interaction of the phosphotransferase system. At the same time, the correlation between the phosphotransferase system and biocontrol effect of Bacillus cereus will discussed in order to reveal the biocontrol mechanism of this bacteria.

蜡样芽孢杆菌是自然界广泛存在的一类具有多种功能的微生物。在医学领域有些蜡样芽孢杆菌是致病菌，其分泌产生的肠毒素可引起呕吐和腹泻等症状。但是在农业及环境科学领域，有些蜡样芽孢杆菌属于益生菌，可以促进植物生长、提高植物的抗病性，还可以用于治理环境污染等。本课题组从小麦根部分离的内生细菌中得到一株对小麦纹枯病具有良好生防效果的蜡样芽孢杆菌，构建了该菌株的转座子插入突变体库，并从该库中筛选得到一批生物薄膜形成能力显著下降的突变体菌株。经反向PCR及序列比对发现其中一株是蜡样芽孢杆菌磷酸转移酶系统组成成分EI蛋白编码基因被转座子插入突变所导致的，该菌株的定殖能力也有显著下降。基于上述前期研究基础，本项目拟对蜡样芽孢杆菌磷酸转移酶系统的结构、功能、各组分之间的互作等进行深入的研究，同时也将对蜡样芽孢杆菌磷酸转移酶系统与该菌发挥生防作用之间的相关性进行初步的探讨，从一定角度揭示蜡样芽孢杆菌的生防机理。

小麦纹枯病是广泛分布于河南省及我国其他小麦主产区的一种重要的土传真菌病害，主要的病原菌是禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）。该病害对小麦产量和品质造成严重影响，是国内外小麦育种学家和植物病理学家高度关注的一种病害。小麦纹枯病的天然抗源较为匮乏，没有高抗品种，抗病育种工作进展缓慢，所以亟需发展建立新的纹枯病抗病策略。生物防治是一种可以显著减少化学药剂在农业中的使用量的有效的、极具吸引力的病害防治方法。在本研究中，我们从健康小麦根部分离得到一株内生蜡样芽胞杆菌0-9菌株，对该菌株的生物防治特征进行了研究。磷酸转移酶系统是细菌中碳水化合物代谢的重要调节因子之一，EI是该系统组成成分之一。通过同源重组双交换的方法，EI蛋白的编码基因ptsI被敲除掉，同时在ΔptsI突变体菌株中实现了ptsI基因的反向互补。ΔptsI突变体菌株的生物薄膜形成能力下降了70%，生防能力下降30.4%，定殖能力降低了3个数量级。在以葡萄糖为唯一碳源的G-tris合成培养基上，ΔptsI突变体菌株的生长能力显著降低。通过对蜡样芽孢杆菌PTS系统对不同糖类的磷酸化和吸收利用情况的分析，结果表明，葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等均是蜡样芽孢杆菌0-9菌株的PTS糖，ptsI基因在PTS系统对糖的磷酸化过程中起到至关重要的作用，该基因功能缺失会导致突变体菌株对葡萄糖的磷酸化和吸收利用能力降低1.6倍，同时也会导致其产胞外酶的能力降低。上述表型变化可以通过ptsI基因的反向互补而恢复到野生型的表型。上述实验结果表明，ptsI基因是蜡样芽胞杆菌0-9菌株生物薄膜形成、定殖及生物防治小麦纹枯病的过程中的关键基因之一，0-9菌株是一株防治小麦纹枯病的理想生防菌。本研究结果为深入研究蜡样芽孢杆菌0-9菌株的生防机理及基于该菌的生防制剂的研发提供了新的理论依据。