特异性识别蓖麻毒素适配体的功能表征及其在毒素毒性作用机理研究中的应用

This project is intended to select three kinds of aptamers by the menas of electrophoretic mobility shift assay (EMSA) or affinity magnetic separation technique from the enrichment libraries obtained in our previous research, which separately recognize enzymatic active site of ricin A chain, galactose binding site of ricin B chain and mannose-type glycans of ricin. Acting as the function indicators of target protein, these aptamers can be applied to real-timely and dynamically reveal the effects of ricin and the complex of ricin and aptamer on the function of living cells when combined with visual labeling technique of QDs. Accordingly, the mechanisms of cytotoxic action of ricin could be systematically explained, thereby exploratory investigating the specific inhibitors of ricin. The research of this project not only builds up a solid foundation for subsequent research and development of specific antidote against ricin, but also has important significance and wide application prospect in preventic medicine, public satety and guarding against bioterrorist attacks.

本项目以前期研究中获得的适配体富集文库为基础，旨在通过凝胶迁移阻滞实验或亲和磁分离等技术手段从中分别筛选出特异性识别蓖麻毒素A链的酶活性位点、B链中半乳糖结合位点以及毒素甘露糖残基糖链结合位点的适配体，以此作为靶标蛋白质功能指示剂，并结合可视化量子点标记技术，实时、动态揭示蓖麻毒素及其与适配体的复合物对活细胞的功能影响，从而全面剖析毒素的毒性作用机理，并在此基础上探索研究蓖麻毒素特异性抑制剂。本项目的研究不仅为后续研发蓖麻毒素特效药奠定基础，而且在预防医学、公共卫生安全和防范生物恐怖袭击等方面具有十分重要的意义和广阔的应用前景。

自“911”恐怖袭击后，生物恐怖已逐渐成为一种主要的恐怖袭击形式，因其具有易行性、突发性、隐蔽性、散发性等特点。近年来已报道多起“白色粉末”形式的恐怖事件，最终确证结果显示，白色粉末多为蓖麻毒素。因此，本项目以蓖麻毒素与其同一家族的相思子毒素为研究对象，开展毒素系统分析方法及特异性适配体筛选及应用研究。.本研究首先开展从蓖麻籽和相思子种子中提取毒素纯品，组合多种层析技术实现毒素的高效提取与纯化，显著缩短纯化流程，提高纯化效率，鉴定结果显示毒素纯度大于95%。在研究中发现，基于抗体的免疫分析法存在非特异交叉反应，分析方法中所用的抗体与蓖麻凝集素以及结构、性质极为类似的相思子毒素存在明显的交叉反应，使得该分析方法无法用于毒素的准确定性。本研究创造性地利用毒素自身含有半乳糖结合位点的特性，并结合纳米磁珠在复杂基质样品预处理中的优势，合成制备了半乳糖功能化的磁性纳米微粒。该半乳糖功能化的磁性微粒可以从复杂体系中同时有效地净化和富集蓖麻毒素与相思子毒素。在经胰酶酶解后，进行高效液相色谱-串联质谱分析鉴定，借助SRM多反应监测模式实现蓖麻毒素和相思子毒素各自专一性、高灵敏度定性、定量检测。基于质谱技术的分析方法解决了免疫分析法存在的缺陷，不仅能有效区分蓖麻毒素和相思子毒素，而且还能区分毒素各亚型以及毒素与毒性较低但同源性极高的凝集素。.毒素发挥毒性作用是源于毒素A链具有糖苷酶活性，催化核糖体RNA而使其失活，从而抑制蛋白质生物合成，导致细胞死亡。根据这一机理，将毒素与rRNA或模拟体内rRNA结构而设计的RNA底物在体外特定的条件下作用，毒素脱去底物分子中的腺嘌呤，通过定量测定释放的腺嘌呤来确定毒素毒性。在本研究中我们重点考察了反应底物，首次发现在适宜的条件下毒素体外脱嘌呤反应无需特定构象的底物，而只是选择性水解腺苷酸，且底物也可以是DNA。本研究结果是目前最便捷、实用的毒性分析法。.最后一部分是利用亲和层析-SELEX技术从ssDNA文库中筛选获得特异识别蓖麻毒素的适配体，由于尚无有效且明确的技术手段研究生物大分子相互作用位点，本研究仍在通过碱基裁剪、毒素位点封闭等技术手段开展适配体与蓖麻毒素作用位点研究，从而进一步开展特异性抑制剂研究。.关键词：蓖麻毒素，相思子毒素，质谱法，毒性分析，适配体