构建PPARγ脂肪组织特异性敲除猪研究其对脂肪沉积的调控机制

Peroxisome Proliferators Activated Receptor γ (PPARγ) is a key gene in regulating lipid metabolism and plays an important role in human obesity and fat deposition in animals. Previous study showed that the whole body knockout of PPARγ gene led to death during embryonic period, and there is a shortage of suitable pig models for studies of the roles of PPARγ gene on porcine fat deposition. Generation of PPARγ gene conditional knockout pigs would facilitate the functional study of PPARγ gene in pigs. However, it’s very difficult to achieve conditional knockout in pigs using conventional transgenic technology. The emergence of CRISPR/Cas9 system offers the promise of generating conditional knockout pigs due to its highly efficiency in gene modification. So, in this proposal, we would like to generate conditional knockout pigs using CRISPR/Cas9- mediated genome engineering, which has been commonly used for porcine gene modifications in our group. We will utilize CRISPR/Cas9 technology to perform conditional knockout of PPARγ gene in porcine fibroblast cells by specifically expressing the Cas9 nuclease in adipose tissue under the control of adipose tissue-specific promoter, and combined with somatic cell nuclear transfer, adipose-specific PPARγ gene knockout pigs will be generated for studying the role of PPARγ gene in lipid metabolism in pigs, which will contribute to the improvement of economic traits. This study will provide an effective tool for gene function study, genetic interpretation of agriculture traits and will promote the application of pigs in human diseases modeling.

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因是调控脂肪代谢的关键基因，对人类肥胖和动物脂肪沉积具有重要的调控作用。研究发现，PPARγ基因的全身基因敲除会导致胚胎致死，因此，PPARγ基因对猪脂肪沉积的影响的研究缺乏合适的动物模型，通过制备条件性PPARγ基因敲除猪将极大推动PPARγ基因对猪脂肪沉积影响的研究。但常规转基因技术几乎不可能实现在猪中组织特异性的敲除，CRISPR/Cas9系统的出现为条件性敲除猪的创制提供了可能。因此，本研究计划以家猪作为研究对象，结合体细胞核移植技术，通过脂肪组织特异性启动子调控Cas9酶的表达，利用转基因一步法制备PPARγ基因脂肪组织特异性敲除猪，并研究PPARγ基因对猪脂肪沉积的影响及其分子信号通路解析，为研究PPARγ基因在猪脂肪代谢中的作用及经济性状的改良奠定基础，也将为猪基因功能的研究和性状遗传基础的解析提供更加广泛的思路。

通过基因修饰技术对猪进行遗传改造从而研究猪的基因功能及解析性状遗传基础，是推动畜牧业发展、加快品种培育的有效解决方案。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因是调控脂肪代谢的关键基因，对动物脂肪沉积具有重要的调控作用，但是PPARγ的全身基因敲除会导致胚胎致死，无法获得PPARγ基因敲除的动物。建立条件性基因敲除技术平台，制备脂肪组织特异性PPARγ基因敲除猪将推动PPARγ对猪脂肪代谢影响的研究。本项目首先以课题组大规模诱变群体中筛选出的突变体为实验动物，建立了CRISPR/Cas9介导的基因定点精确修饰平台；构建了由脂肪组织特异性启动子（adiponectin启动子）启动Cas酶和U6启动sgRNA的表达载体，在猪脂肪细胞分化过程中验证了对PPARγ基因进行特异性敲除的有效性；随后将线性化的表达载体转染猪胎儿成纤维细胞，筛选转基因阳性的单细胞克隆，对单细胞克隆进行成脂分化诱导，在诱导后的脂肪细胞中检测到PPARγ基因被成功敲除，且脂肪分化被明显抑制；以此单细胞克隆为核供体，结合体细胞核移植技术，制备了脂肪组织特异性PPARγ敲除猪，其脂肪组织中的PPARγ基因表达显著降低，且脂肪组织形态异常。本项目成功建立了猪的条件性敲除技术平台，证实了利用脂肪组织特异性启动子启动Cas9酶和U6启动sgRNA可以在猪上实现CRISPR/Cas9系统介导的条件性敲除，为猪的重要功能基因研究及农业性状的遗传解析提供了新思路；对在脂肪代谢中具有重要调控作用的PPARγ基因进行脂肪组织特异性敲除后，猪的脂肪细胞分化及脂肪组织的形成均受到抑制，为研究PPARγ基因在猪脂肪代谢中的作用及经济性状的改良提供理论基础。