跨膜转运蛋白21（TMP21）对引起阿尔茨海默病（Alzheimer'S Disease）的γ分泌酶的作用研究

阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)是由γ分泌酶活性升高导致Aβ40和Aβ42在脑中异常沉积而引起。跨膜转运蛋白21（TMP21）是γ分泌酶复合物组分之一。本课题拟以淀粉样前体蛋白（APP）基因缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞（MEFko）为模型，研究TMP21对介导AD的γ分泌酶的影响。项目将采用核糖核苷酸干扰技术（siRNA）和脱氧核糖核酸超表达技术（cDNA），研究TMP21在MEFko细胞模型中的表达状况；运用Western Blotting 检测TMP21在不同表达状态下对γ分泌酶组分PS-1,NCT, Pen-2 ,APH-1 表达量的影响；建立以外源性 C99为底物，Aβ40及Aβ42 为产物的反应模型；采用ELISA法研究TMP21在不同表达状态下对γ分泌酶活性的影响。通过研究TMP21对 γ分泌酶活性的影响，可为寻找调节细胞关键酶的亚基治疗AD提供新思路。

本课题以淀粉样前体蛋白（APP）基因缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞（MEFko）为模型，研究TMP21对介导AD的γ分泌酶的活性的影响。项目采用核糖核苷酸干扰技术（siRNA）和脱氧核糖核酸超表达技术（cDNA），研究了TMP21在MEFko细胞模型中的表达状况；运用Western Blotting 检测TMP21在不同表达状态下对γ分泌酶组分PS—1,NCT表达量的影响；建立了以外源性 C99为底物，Aβ40及Aβ42 为产物的反应模型；采用ELISA法测定了TMP21在不同表达状态下对γ分泌酶活性的影响。.全部内容均按计划执行，并超额完成了任务，适度做了一些拓展性研究，取的了预期的研究成果：.1、对γ分泌酶的各组成成分及APP-CTF性质的研究。研究表明，PS在γ分泌酶主要起到切割的作用，APP-CTF的膜外切割可能存在一种膜外双酶（γ分泌酶和ε分泌酶）切切割机制即可能存在α、β、γ以外的酶切新位点ε。.2、跨膜转运蛋白21大部分游离于细胞液中，少部分与γ-secectase结合。跨膜转运蛋白21可与PS-1共沉降，证明跨膜转运蛋白21是γ分泌酶复合物的组分之一。.3、构建了跨膜转运蛋白21的干扰载体，经检测干扰载体细胞模型构建成功。进行干扰载体检测时研究发现跨膜转运蛋白21干扰后，对PS1复合物的影响较大，.4、在MEF（KO）细胞中，跨膜转运蛋白21干扰处理后，经蛋白免疫印记检测显示跨膜转运蛋白21表达量下降，同时构成γ分泌酶复合物重要组分NCT与PS-1的表达没有明显变化。ELISA检测由γ分泌酶切割淀粉样前提蛋白APP产生的Aβ40及Aβ42 的量明显升高。结果证明γ分泌酶活性升高。.5、MEF（KO）细胞中，跨膜转运蛋白21在MEF（KO）细胞中超表达，经蛋白免疫印记检测显示跨膜转运蛋白21表达量提高，同时构成γ分泌酶复合物重要组分NCT与PS-1的表达没有明显变化。ELISA检测由γ分泌酶切割淀粉样前提蛋白APP产生的Aβ40及Aβ42 的产量下降 ，证明γ分泌酶活性降低。.6、跨膜转运蛋白21可能与γ-分泌酶的组成成分Nicastrin （NCT）发生作用，对Aβ40和Aβ42的活性有抑制作用。但是具体的结合区域还是不清楚，有待于进一步的研究工作。