阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）动物模型构建的分子机理研究

阿尔茨海默病型老年性痴呆(Alzheimer disease，AD) 是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，病理改变主要以神经元丧失、细胞外淀粉样肽沉积、老年斑或神经炎斑、神经元胞浆内出现神经纤维缠结和淀粉样血管病为特征，患病率随年龄增加而明显上升。随着人口老年化进程的加快，这种疾病将严重困扰着社会、家庭、经济以及公共卫生。但目前对于阿尔茨海默病的发病机理仍不十分清楚，建立AD动物模型，为研究其发病机理和治疗方法的探讨提供必要的条件支撑是非常必要的。本研究以广西巴马小型猪作为实验动物来构建AD分子机理研究的动物模型，通过克隆广西巴马小型猪AD相关基因并与人类的序列进行比对，构建广西巴马小型猪神经组织特异性表达启动子-高致病性APP突变型转基因载体，利用显微注射、精子载体法等方法获得AD转基因猪，为人类医学相关的研究提供转基因动物模型，具有重要的现实意义。

阿尔茨海默病型老年性痴呆(Alzheimer disease，AD) 是一种神经退行性疾病，其标志性的病理变化为大脑细胞外出现老年斑（Senile pluque，SP）和细胞内出现神经纤维缠结（Neurofibrillary tangles，NFT），有研究认为这主要是APP经不同的剪接方式，产生不溶性的Aβ积聚和Tau蛋白的过度磷酸化而造成。本研究以广西巴马小型猪作为实验动物，根据GenBank中猪的APP、PS1、PS2、APOE和Tau基因序列，设计引物以广西巴马小型猪脑组织总RNA进行RT-PCR，获得了广西巴马小型猪APP、PS1、PS2、APOE和TAU基因序列，其中广西巴马小型猪Tau基因序列与参考序列比较少了1134bp，应用巢式PCR和5'RACE方法验证得到了四个可变剪接体。成功构建了广西巴马小型猪神经组织特异性表达启动子PDGF-β305和真核表达载体pEGFP-APP、pEGFP-C1-APP、pEGFP-C1-ApoE、pPDGF-β305-Tau1215-EGFP-1和pPDGF-β305-Tau1215-EGFP-N1，并利用PK15和PC12细胞对pEGFP-C1-ApoE载体的功能进行了验证，结果证明真核表达载体pEGFP-C1-ApoE 在PK15和PC12细胞中均能正常表达目的蛋白；pPDGF-β305-Tau1215-EGFP-1和 pPDGF-β305-Tau1215-EGFP-N1转染PC12细胞均发现标记绿色荧光蛋白有表达，但也发现ApoE和Tau对细胞具有凋亡作用。. 利用脂质体介导法将质粒pPDGF-β305-Tau1215-EGFP-N1和pEGFP-C1-ApoE分别直接注入小鼠睾丸及卵巢，通过自然交配的方法，获得F1代小鼠，PCR验证结果获得APOE转基因阳性小鼠2只，Tau转基因阳性小鼠15只。. 利用RT-PCR和免疫组化分析，结果发现ApoE在广西巴马小型猪脑和胰腺的表达最高，在前脑皮质的表达量高于海马组织；在老年巴马小型猪（>24月龄）脑组织中的ApoE表达量高于其它年龄。. 通过该项目的研究，获得了广西巴马小型猪与AD病相关基因的变异特点，多种可变剪接体为人类探讨AD发病机理提供了分子理论基础；转基因技术平台的建立为进一步制作广西巴马小型猪阿尔茨海默病模型奠定基础。