Viperin抗埃博拉病毒的特性与其机制的研究

Ebola virus (EBOV) is a highly pathogenic RNA virus in human, with fatality rate up to 90%. Recent outbreak of EBOV poses a serious threat to global health. Currently, there are no FDA-proved vaccines and therapy for EBOV, which thus demands a better understanding of how host anti-viral proteins control virus infection. Notably, the interferon-mediated innate immune response has been reported to play important roles in defending EBOV infection, mainly by regulating the induction of interferon-stimulated genes (ISGs). In the early stage of this project, we applied the advanced modeling system of EBOV lifecycle (EBOV tetracistronic trVLP assay), and found that infection of EBOV trVLPs in human epithelial A549 cells induces Viperin expression, which in turn inhibits viral replication. Based on previous results, we will investigate the roles of Viperin in EBOV production and infectivity, and thus define its underlying mechanisms. In addition, we will determine the functional domains by which Viperin inhibits EBOV replication as well as how positive selection of Viperin contributes to its activity. Overall, our work will greatly benefit therapeutics against the deadly virus.

埃博拉病毒是一种高致命性的RNA病毒，在人类中致死率最高达90%，而目前尚无确实有效的疫苗和治疗药物。固有免疫应答中干扰素刺激基因对抵抗埃博拉病毒感染有重要的意义。申请人长期从事埃博拉病毒感染和抗病毒蛋白相关的研究，具有大量工作积累。经前期研究发现，埃博拉病毒样颗粒trVLPs的感染在人肺上皮细胞A549中诱导干扰素刺激基因Viperin的表达。通过构建Viperin过表达和敲低细胞系，进一步发现Viperin对埃博拉病毒复制起显著的抑制作用，而目前尚无报道。本课题将根据前期研究基础，利用新型病毒复制的实验模型（EBOV tetracistronic trVLP assay），明确Viperin对该病毒生产能力、感染性等方面的影响，阐明其作用机制。利用基因突变等方法确定Viperin的关键基因结构域，探讨在物种进化中其正向选择与埃博拉病毒的关系，为治疗该病毒奠定理论基础。

埃博拉病毒（EBOV）是人类的一种高致病性RNA病毒，病死率高达90％。近年来爆发的EBOV疫情对全球健康构成了严重的威胁。但当前尚无FDA批准的EBOV疫苗和疗法。因此，我们需要更好地了解抗病毒蛋白如何控制病毒感染。文献指出，固有免疫应答中干扰素刺激基因对抵抗埃博拉病毒感染有重要的意义。在本项目中，我们发现了干扰素诱导的Viperin蛋白能有效抑制EBOV的复制，进而我们深入研究其作用机制。通过使用具有复制能力的EBOV四顺反子微型基因组系统（trVLP），我们证明EBOV感染能诱导人A549细胞中Viperin的表达，进而抑制EBOV复制。与此发现一致，在A549细胞中敲除Viperin可增强EBOV复制。进一步的实验表明，Viperin会严重损害EBOV的产生，但对病毒入侵的影响较小。通过使用基于EBOV VP40的病毒样颗粒（VLP）和小型基因组（trVLP）系统，我们发现Viperin通过降低病毒生产细胞中的VP40水平很强地阻断了EBOV的产生。此外，溶酶体降解抑制剂CQ，NH4Cl和BafA1处理细胞可以有效地挽救VP40的降解，这提示了细胞自噬可能参与其中。由此，我们验证了Viperin的过表达会诱导LC3脂化，上调Beclin-1和ATG5的蛋白水平，增加GFP-LC3介导的自噬斑的形成。与Viperin的作用一致，雷帕霉素诱导的自噬同样可阻断EBOV的产生，而自噬抑制剂3-MA或自噬基因的小干扰siRNAs可消除Viperin的作用。通过免疫染色和免疫沉淀，我们发现在细胞内Viperin与LC3和VP40存在相互作用。随着P62的敲低，而不是Rubicon的敲低， EBOV VLP的产生增加，这表明异种自噬参与了由Viperin介导的病毒抑制作用。最后，非人类灵长类动物Rhesus Viperin显示出比人类来源更强的抗病毒活性，提示了Viperin的关键结构域。总而言之，我们的结果表明，Viperin通过自噬介导的VP40降解抑制了EBOV产生，表明Viperin与细胞自噬途径相互作用可以限制EBOV感染。我们的工作将大大有益于治疗致命病毒的疗法。